전하 균형을 이룬 화학 선택성 링커(CHARGE-BALANCED CHEMOSELECTIVE LINKERS)

공개특허 10-2005-0007454
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(19)대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(51) 。Int. Cl.7
C07C 39/06
C07C 39/14
C07C 43/23
(11) 공개번호
(43) 공개일자
10-2005-0007454
2005년01월18일
(21) 출원번호 10-2004-7015992
(22) 출원일자 2004년10월07일
번역문 제출일자 2004년10월07일
(86) 국제출원번호 PCT/GB2003/001505 (87) 국제공개번호 WO 2003/087824
(86) 국제출원출원일자 2003년04월07일 (87) 국제공개일자 2003년10월23일
(30) 우선권주장 0208061.2
0216516.5
2002년04월08일
2002년07월16일
영국(GB)
영국(GB)
(71) 출원인 아무라 테라피틱스 리미티드
영국 캠프리지 씨비3 7에이제이 바톤 로드 호리즌 파크
(72) 발명자 플린니콜라스션
영국 캠브리지 씨비4 0더블유에스 바톤 로드 호리즌 파크 인센타 하우스 아무라 테라피틱
스 리미티드내
퀴벨마틴
영국 캠브리지 씨비4 0더블유에스 바톤 로드 호리즌 파크 인센타 하우스 아무라 테라피틱
스 리미티드내
터넬윌리엄고든
영국 캠브리지 씨비1 1이엘 이든 스트리트 57
람지마노지쿠마르
영국 캠브리지 씨비4 0더블유에스 바톤 로드 호리즌 파크 인센타 하우스 아무라 테라피틱
스 리미티드내
(74) 대리인 유미특허법인
심사청구 : 없음
(54) 전하 균형을 이룬 화학 선택성 링커
요약
본 발명은 하기 일반식 (Ia 내지 Ie)에 따른 양전하 균형을 이룬 링커(linker), 또는 그의 염, 수화물, 용매 화합물(solv
ate), 착물 또는 전구약물에 관한 것으로서, 캐리어 단백질에 에피토프를 접합하기 위한 링커로서 이용된다:
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(상기 일반식 Ia 내지 일반식 Ie에서,
X= O 또는 S이고;
Y는 O, S, CH 2 , CHR 또는 CRR(단, 각각의 R은 C 1-7의 알킬)이고;
Z는 O 또는 S이고;
R 1 은 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 2 는 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 4 는 상기 방향족환에서 임의의 빈 자리에 존재하는 H 또는 C 1-7의 알킬이 고;
R 3 는 C 1-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH, C 3-10의 사이클로알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH 또는
Ar-C 0-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH이되,
각각의 L 1 및 L 2 가 부재이거나, 각각의 L 1 및 L 2 가 아미드 CONH와 같은 적절한 링커이거나; 또는 에테르 -O
-, 티오에테르 -S-, 또는 설폰 -SO 2 -이고;
R 5는, R 5가 양전하를 함유하도록, 각각 NR 8R 9 (질소 원자가 용액 중에서 N HR 8R 9 를 제공하도록 프로
톤화될 수 있는 것), 또는 4급 질소 원자 N R 8R 9 R 10으로 치환된 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또
는 Ar-C 0-7의 알킬이고;
R 6는 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이며,
R 8, R 9 및 R 10은 각각 독립적으로 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이거나, 또는
R 8, R 9 및 R 10중 2종 이상이 함께 지방족환 또는 아릴지방족환 시스템을 형성하는 것임).
색인어
화합물, 링커, 접합체, 에피토프, 미모토프, 양전하 균형
명세서
기술분야
본 발명은 복수 개의 활성 모이어티가 구조체의 형성에 유용한 캐리어(예를 들면, 단백질, 유리 슬라이드 또는 폴리머
표면) 및 링커(linker)에 결합된 구조체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 화학 선택적(chemoselective)이고 선택적으
로 정량화 가능한 정도의 로딩(loading)을 갖는 구조체에 관한 것이다. 그 예로서, 높은 로딩의 가용성 단백질 구조체
를 들 수 있으며, 상기 구조체의 활성 모이어티, 즉, 에피토프(epitope)가 링커를 통해 캐리어에 결합되어 있다. 상기
링커 역시 본 발명에 포함되며, 상기 링커는 상기 활성 모이어티와 캐리어 간의 화학 반응 지점을 화학 선택적으로 조
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절할 수 있으며, 로딩된 캐리어 표면에서의 전하 패턴이 로딩되지 않은 캐리어의 전하 패턴과 유사하도록 하는 것으
로서 선택된다.
배경기술
캐리어에 대한 활성 모이어티의 공유 화학 결합 반응은 다양한 범위의 과학 법칙에 있어서 핵심이 되는 기본적인 프
로세스이다. 예를 들어, 펩타이드, 올리고당, DNA 또는 소형의 생체 활성 유기 분자를 유리 슬라이드나 유리 칩에 부
착한 것을 이를테면, 신규 화합물에 대한 독성 시험이나 유전적 프로파일 등에 적용함으로써, 진단 스크리닝의 광범
위한 분야를 이루어 왔다. 또한, 동일한 타입의 분자를 폴리머 표면에 부착함으로써, 상처 드레싱 프로세스를 개선하
도록 생리적 반응을 유도하는 소형 분자/단백질 및 스마트 상처 드레싱(smart wound dressing)의 친화적 분리(affini
ty purification) 등과 같이 다양한 분야에 적용할 수 있다. 그 대안으로서, 전술한 바와 같은 분자들을 면역 자극 단백
질에 부착함으로써, 합성 백신 개발 분야에 적용할 수 있다.
이러한 각각의 분야에 적용 시에 그 성공 여부는 화학적 및 생화학적으로 중요한 여러 핵심 파라미터들의 엄격한 조
절에 따라 좌우된다. 본 발명의 주된 목적은, 분자의 표시 및 생화학적 특성에 있어서 최적의 조합을 나타내는 최종 구
조체를 제공할 수 있도록, 공유 결합 화학의 정량 및 정량적 조절을 획득하기 위한 것이다. 이 같은 적용을 통해, 다양
한 화학적 분야, 및 펩타이드, 올리고당, DNA 또는 소형 생체활성 유기 분자와 같은 활성 모이어티에 내재된 고유 특
성, 및 폴리머 비드(polymeric bead) 또는 단백질과 비교하여 상이한 유리 슬라이드의 생화학적 물성이 제공되도록,
이러한 핵심 필수 요소들을 다양한 변형 사항들을 고려할 수 있다.
가령, 펩타이드 에피토프를 표시하는 합성 백신의 개발 시에는 하기와 같은 여러 변형 사항들을 고려해 볼 수 있다.
통상적으로, 백신 개발용 에피토프로서 밝혀진 펩타이드는 구조체를 통해 체내의 저분자량 면역원의 면역 반응이 유
발되도록, 캐리어 단백질에 결합되어 있어야 한다. 이는 하기 도식 1에 나타난 바와 같으며, 이 도식에 따르면, 에피토
프(1)가 접합체(2, conjugate) 및 캐리어 단백질(3)과 반응하여 구조체(4)를 형성한다. 이상적인 백신 구조체라면, 높
은 수용성을 유지하는 한편, 캐리어 단백질에 결합되고 표면 적용 범위(surface coverage)가 높은 에피토프를 함유
할 수 있다. 나아가, 이상적으로는 상기 캐리어 단백질과 에피토프 사이에 생성된 결합이 면역적으로 불활성이며, 상
기 결합은 에피토프의 인지에 결정적인 잔기 또는 작용기를 포함하지 않을 수 있다(Briand. J.P., Muller, S. and Van
Regenmortal, M.H.V.J. Immunol. Methods78, 59-69, 1985). 현재, 실험 백신의 제조에 있어서 가장 일반적으로
이용되는 방법인 결합법(conjugation)으로서, 글루타르알데히드(Avrameas, S. and Ternynck, T.Immunochemistr
y6, 53, 1969; Korn, A.H., Feairheller, S.H. and Filachione, E.M.J. Mol . Biol .65, 525, 1972; Reichlin, M. in:
Methods in Enzymology, vol. 70, eds. Van Vunakis, H. and Langone, J.J. [Academic Press, New York] pp. 1
59-165, 1980), 카르보디이미드(Goodfriend, T.L., Levine, L. and Fasman, G.D.Science144, 1344, 1964; Bau
minger, S. and Wilch다, M. in:Methods enzymology, vol. 70, eds. Van Vunakis, H. and Langone, J.J. [Aca
demic Press, New York] pp. 151-159, 1980), 비스-디아조화된 벤지딘(BDB: bis-diazotized benzidine)(Gordan
, J., Rose, B. and Sehon, A.H.J. Exp. Med.108, 37, 1958)과의 화학적 비특정 반응이 포함되거나, 또는 티올 모이
어티의 존재 여부에 의존적인 말레이미드 유도체를 이용한다(Liu, F.-T., Zinnecker, M., Hamaoka, T. and Katz, D.
H.Biochemistry18, 690,1979; Yoshitake, S., Yamada, Y., Ishikawa, E. and Masseyeff, R.Eur . J. Biochem .1
01, 395-399, 1979; Green, N., Alexander, H., Olson, A., Alexander, S., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G. and Ler
ner, R.A.Cell28, 477, 1982).
에피토프의 화학적 특성은 특히, 펩타이드 에피토프 분야에 있어서 급속하게 진보하고 있기 때문에, 이제는 더 이상
전술한 많은 기술들을 보다 향상된 에피토프 화학과 완전히 공용할 수 없게 되었다. 천연 환경에서의 에피토프와 구
조적으로 유사한, 디설파이드 억제된 펩타이드 루프를 사용하는 것과 같이, 향상된 구조적 특성 및 디자인 요소를 도
입하려면, 로딩된 에피토프의 화학적 통합을 개선하기 위해 독특하면서도 세밀하게 조정된 결합법을 이용해야 한다.
그런데, 현재 이용되는 결합법들은 실험적으로 많은 문제점이 있다(도식 1):
(a) 구조체로부터, 로딩된 에피토프, 즉, 많은 화학 공정에 참가했으며 종종 화학적으로 민감한 에피토프에 대한 정성
적 및 정량적 평가가 어렵다는 점(Briand. J.P., Muller, S. and Van Regenmortal, M.H.V.J. Immunol . Methods78
, 59-69, 1985),
(b) 통상적으로, 에피토프와 결합된 캐리어 단백질의 표면 로딩이 증가함에 따라, 상기 구조체의 용해성이 낮고 예측
불가능하게 관찰되는 점(Qamar, S., Islam, M. and Tayyab, S.J. Biochem 114, 786-792, 1993),
(c) 말레이미드 기재의 결합을 이용하는 경우에 필요한 티올 작용기에 의해, 디설파이드 결합된(disulfide-bridged)
펩타이드의 도입이 복잡해지고, 디설파이드 결합이 붕괴될 수 있다는 점.
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(도식 1) 캐리어 단백질과 항원을 접합하는 통상의 방법.
전술한 여러 문제점은 국제특허 A-0,145,745에 기재된 신생 구조체에서 언급되기 시작한 것으로, 상기 특허에는 캐
리어 단백질에 대한 펩타이드 에피토프의 결합을 조절하는 방법에 관해 기재되어 있다. 이 방법은, 도식 2 및 도식 3
에 도시한 바와 같은 간단한 화학적 수단을 이용하여, 구조체로부터의 에피토프 로딩을 정성 및 정량적으로 평가할 수
있는 구조체(7)를 제공한다.
(도식 2) 국제특허 A-0,145,745호에 기재된 캐리어 단백질에 대한 에피토프의 접합 제어
국제특허 A-0,145,745에는 카르복시산 및 알데히드 작용기를 함유하는 화학 적 링커(5)에 대해 기재되어 있다. 상기
카르복시산은 상기 링커와 상기 캐리어 단백질에 접근 가능한 표면의 리신 잔기들 사이에 2차 아미드 결합을 형성함
으로써, 상기 캐리어 단백질에 대한 결합점을 제공-중간체 링커-캐리어 단백질(6)을 생성하는 방법-한다. 상기 알데
히드 작용기는 화학적으로 가역적인 조절 방법으로 펩타이드 에피토프에 대한 결합점을 제공한다. 상기 펩타이드 에
피토프 자체는 복수 개의 화학 반응성 작용기(아민, 카르복시산, 티올, 알코올, 이미다졸, 인돌을 함유하는 아미노산
잔기 측쇄)를 포함할 수 있기 때문에, 합성 과정 중에 상기 에피토프 내로 도입되는 히드라지드 작용기와의 화학 선택
적 반응을 통해 반응의 조절(6)이 가능하다(도식 3 참조).
(도식 3) 국제특허 A-0,145,745호에 기재된 캐리어 단백질에 대한 에피토프의 제어된 가역적 접합 반응
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약염기인 상기 히드라지드는 온화한 산성 pH 조건의 (6)에서 알데히드 작용 기와 함께 안정한 아실-히드라존 결합을
형성한다. 이 pH 조건에서, 에피토프의 염기성 측쇄의 친핵체가 프로톤화되어, 상기 결합 반응으로부터 제외된다(Jen
cks, W.P.J. Am. Chem . Soc .81, 475-481, 1959; Reeves, R.L. in:The Chemistry of the Carbonyl Group, ed
. Patai, S. (Interscience, London) pp. 600-614, 1966). 이러한 히드라존 형성 반응은, 통상 특이적 단백질 및 펩타
이드 내에 존재하는 N-말단 세린 잔기의 소듐 메타페리오데이트 매개 산화 반응에 의해 형성된 C-말단의 히드라지
드 및 N-말단의 알데히드를 통해 우선적으로 결합 반응에 이용되어 왔다(King, T.P., Zhao, S.W. and Lam, T.,Bioc
hemistry25, 5774-9, 1986; Rose, K., Vilaseca, L.A., Werlen, R., Meunier, A., Fisch, I., Jones, R.M. and Offor
d, R.E.Bioconj . Chem .2, 154-159, 1991; Gaertner, H.F., Rose, K., Cotton, R., Timms, D., Camble, R. and O
fford, R.E.Bioconj . Chem .3, 262-268, 1992).
국제특허 A-0,145,754호에 기재된 상기 방법은 결합 과정의 조절에 의해서 종래의 방법에 비해 확실히 개선된 것이
다. 이 방법을 이용하면, 손상되지 않은 에피토프(1)의 화학적 방출 및 분석적 특성을 통해 구조체의 성질을 고수준으
로 조절할 수 있다.
국제특허 A-0,145,754호에 기재된 방법은 이전의 방법에 비해 괄목할 만하게 진보된 것이다. 그러나, 구조체의 용해
성이라는 전반적인 문제, 그리고 동시에 항체의 증가에 대한 우려 및 예방 접종에 대해서는 다룬 바가 없다.
소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin), 오브알부민(ovalbumin) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole lim
pet haemocyanin)과 같이 광범위하게 이용되 어 온 캐리어 단백질은 미세하게 전하 균형을 이룬 표면 분포를 갖는다
. 그런데, 이러한 캐리어 단백질 및 기타 단백질에 링커/에피토프 제제를 결합시키는 경우에는 상기 단백질 내 전하의
균형 및 분포가 깨져, 등전점(pI: isoelectric point)에서 전체적인 변화가 일어나고, 종종 해당 pH에서 수용성이 불량
한 결합체를 초래하게 된다. 도식 3에 상세하게 도시한 바와 같이, 각각의 링커 유닛은 접근 가능한 표면 리신 잔기와
반응하여 2차 아미드 결합을 형성함으로써, 상기 캐리어 단백질 표면으로부터 양전하를 제거한다. 상기 캐리어 단백
질의 표면 적용 범위가 증가하기 때문에, 상기 구조체 내에서의 입체 장애성(steric hindrance)이 증대됨에 따라, 상
기 불균형한 표면에서 음전하가 함께 증가된다(Ansari, A.A., Kidwai, S.A. and Salahuddin, A.J. Bio . Chem .250
, 1625-32, 1975). 이전의 BSA의 숙신화 연구에서 나타난 바와 같이, 87%가 숙신화된 경우에는 스토크스 반지름(St
okes radius)이 3.7 내지 6.3 ㎚로 변화되는 것으로 관찰되었으며, 아실화 반응 수준이 증가함에 따라 형태 변화가 야
기된다(Tayyab, S. and Qasim, M.A.B ochim . Biophys. Acta913, 359-367, 1987). 이로 인해 결국에는 상기 캐
리어 단백질 3차 구조의 불안정화와 상기 구조체의 석출이 초래될 수 있다. 또한, 네트(net) 음전하가 증가되기 때문
에, 상기 개질된 단백질의 PI가 저하된다. 따라서, 용매의 pH가 저하되고 새로운 등전점에 도달하면, 산성의 배지에
단백질이 석출되는 경향이 나타나고, 대부분 그렇게 된다(Shaw, K.L., Grimsley, G.R., Yakovlev, G.I., Makarov, A.
A. and Pace, C.N.Prot . Sci. 10, 1206-15, 2001). 에피토프와 링커-캐리어 단백질과의 사이에 최종적으로 형성
되는 히드라존 결합은 산성 pH(pH 2.1 이하)에서 수행되기 때문에, 이는 특히 본 발명의 바람직한 결합 방법과 관련
이 있다(Rose, K., Zeng, W., Regamey, P.O., Chernushevich, I.V., Standing, K.G. and Gaertner, H.F.Bioco j .
Chem .7, 552-556, 1996). 실제로, 국제특허 A-0,145,745호의 경우에, 에피토프의 로딩 이전에 링커-캐리어 단백
질 중간체(6)가 석출되는 것이 관찰되었다.
높은 표면 적용 범위에서 구조체의 불용성이 나타나는 주요 원인은 에피토프-링커의 로딩 시에 불균형한 표면 전하
가 형성되기 때문일 수 있다. 이에 따라, 작용기를 제공하는 양전하를 변화시킴으로써 단백질의 등전점에서 네트 전
하를 저하시킬 수 있으며, 다른 한편으로, 음전하를 제공하는 작용기를 변화시킴으로써 단백질 등전점에서의 네트 전
하를 증가시킬 수 있다. 용해도와 pH는 단백질 등전점의 함수 관계이기 때문에, 화학 변화를 통해 잃은 양전하 또는
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음전하 중 하나를 대체할 수 있으므로 개질된 단백질의 수용성을 제어/향상하는 데 효과적일 수 있다. 이를 위해서는
전하 균형을 이룬 링커(8)를 고안 및 구성해야 할 필요가 있다. 구조체 내 전하 균형의 회복은 개념상 간단한 것으로
서, 본 발명의 경우에 있어서는, 결합 도중에 치환된 것을 대체할 아민을 포함함으로써 이루어질 수 있다(음전하는 쉽
게 분리되는 프로톤을 함유하는 작용기, 이를테면, 히드록시산 또는 카르복시산 모이어티를 함유하는 작용기를 포함
함으로써 치환될 수 있음). 그러나, 초기의 링커-캐리어 단백질 형성 반응이 아미드 결합 형성 반응을 포함하기 때문
에 이러한 전하 회복 방법은 평범한 방법이 아니며, 이처럼, 링커 내에 임의의 아민 작용기는 상기 링커와 캐리어 단백
질의 아실화 반응 이전에 보호되어야 하고, 상기 아실화 반응 이후에는 탈보호(unmasked)되어야 한다. 전하 회복을
위한 보다 실용적인 접근법으로는 4급 암모늄기를 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 4급 질소는 추가의 아실화 반응에
대해서 불활성을 유지하면서 양전하를 제공한다.
4급화 반응이 단백질의 용해도에 끼치는 효과에 대한 기록이 있으며(Yamada, H., Seno, M., Kobayashi, A., Moriya
ma, T., Kosaka, M., Ito, Y. and Imoto, T.J. Biochem .116, 852-857, 1994), 이러한 4급화 반응은 합성 폴리머
및 거대분자 구조체의 용해성을 향상시키는 데에도 이용되어 왔다(Ishizu, K. and Kitano, H.J. Colloid Interface Sc
i .229, 165-167, 2000; Thanou, M.M., Kotze, A.F., Scharringhausen, T., Luessen, H.L. de Boer, A.G., Verho
ef, J.C. and Junginger, H.E.J. Contr : Release64, 15-25, 2000). 상기 캐리어 단백질에 이러한 링커를 결합시킴
으로써, 로딩량이 높고 가용성을 나타내며, 양전하의 균형을 이룬 링커-캐리어 단백질(9)을 얻을 수 있다(도식 4 참조
). 또한, 이 같은 용해 특성의 향상뿐만 아니라, 상기 구조체(9)를 후보 백신의 균일한 제조가 가능하고, 상이한 면역원
을 보다 정밀하게 비교할 수 있는 핵심 스톡 시약(core stock agent)으로서도 제조할 수 있다.
(도식 4) 높은 로딩 특성 및 가용성을 나타내는 양전하 균형을 이룬 링커-캐리어 단백질 접합체
그 다음으로 구조체의 제조 시에 바람직한 특성은 실시간 분석 모니터링 및 결합 프로세스의 제어가 가능하다는 점이
다. 국제특허 A-0,145,457호에 기재된 모니터링 방법에 따르면, 손상되지 않은 에피토프를 구조체로부터 화학적으
로 분해하하여 해리시킨다. 그러나, 이러한 모니터링을 통해 결합 프로세스를 조절할 수 있기 때문에, 구조체를 분해
할 필요가 없는 경우라면 구조체의 형성 속도 및 형성 정도를 모니터링하기에 유리할 수 있다.
상기 구조체의 용해도 증가는 대개 용액상으로 적용하는데 중요하기 때문에, 반응 속도 및 반응 정도를 모니터링 가
능 여부는 고상 및 용액상 모두에 적용하는데 있어서 중요하다.
확실하게 양전하의 균형을 이룬 링커(8)의 설계 및 제조 시에는 하기와 같은 다양하게 상관된 성질을 고려해야할 필
요가 있다:
(a) 이상적으로, (8) 내의 양전하는 커플링 시에 제거되는 캐리어의 표면 전하(예: 단백질 표면의 리신 전하)에 매우
근접해 있어야 하며, 중간 정도의 pKa값 을 제공해야 함,
(b) (8)의 제조 반응은 원활하고 재생 가능한 것이어야 함,
(c) (8)의 카르복시산 활성화 반응을 수행한 다음, 상기 캐리어(예: 캐리어 단백질)에 첨가하는 반응을 수행하되, 양전
하에 의한 방해가 최소인 상태에서 순조롭게 수행해야 함,
(d) (8)과 캐리어(예: 캐리어 단백질) 사이의 2차 아미드 결합 형성 반응은 양전하에 의한 방해가 최소인 상태에서 순
조롭게 수행되어야 함,
(e) 활성 모이어티-히드라지드(예: 에피토프-히드라지드)와 양전하 균형을 이룬 링커-캐리어 단백질(9) 사이의 아실
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히드라존 결합 형성 반응은 양전하에 의한 방해가 최소인 상태에서 순조롭게 수행되어야 함,
(f) 상기 활성 모이어티-히드라지드(예: 에피토프-히드라지드)와 (9) 사이의 아실 히드라존 결합의 가역성 산이 불안
정하기 때문에, (8)의 링커 요소가 전자가 풍부한 방향족 모이어티이어야 할 필요가 있음,
(g) 상기 활성 모이어티-히드라지드(예: 에피토프-히드라지드)와 (9) 사이의 아실 히드라존 결합의 가역성 산의 불안
정성이 양전하의 존재에 의해 유리하게 변해야 함.
상기 구조체 형성 과정이 파괴적인 분석법을 이용하여 모니터링되는 경우라면, (a)→(g)에 기재한 성질에 해당하는
결정적인 이론상의 설계 요소는, 상기 구조체(9)에 로딩된 에피토프 히드라지드의 분해적 분석을 요하기 때문에, 상기
구조체 내에 활성 모이어티(에피토프) 아실 히드라존 결합의 가역성 산 불안정성을 유 지시킨다(도식 5).
그러나, (9) 내 존재하는 알데히드 작용기가 적절히 유도화된 모이어티(R기)에 결합된다면, 상기 캐리어 단백질 단독
과 종(9), 그리고 (10) 사이에서의 흡광 및 형광 스펙트럼 차이를 분석함으로써, 적절한 pH 조건 하에서 구조체 형성
과정 전반에 대한 실시간 분석 모니터링 및 조절이 가능하다고 할 수 있다.
(도식 5) 에피토프 히드라존-링커 구조체(9)의 가수분해 메카니즘
(10)의 산 촉매화 가수분해 반응 메카니즘은 (11)을 제공하는 탄소-질소 이중 결합에 물을 첨가하는 반응을 통해 진
행된다. 상기 첨가 반응 이후에는 에피토프 아실 히드라지드의 제거 반응(따라서, 분석에 쉽게 이용될 수 있음)이 수
행되고, 중간체인 카르보 양이온(12)이 형성된 다음, 프로톤을 잃고 구조체(9)를 얻을 수 있다. 이러한 가수분해 과정
은 카르보 양이온(12)의 공명 안정화(resonance stabilization)에 의해 유용해질 수 있다.
(도식 6) 카르보 양이온(12)의 공명 안정화
카르보 양이온(12)의 공명 안정화는 방향족환, 바람직하게는 전자가 풍부한 방향족환, 더욱 바람직하게는 오르쏘 및
파라 위치에 치환된 π 전자 공여 치환체를 함유하는 환을 통해 매우 쉽게 이루어질 수 있다(도식 6 참조). 이에 대한
다양한 예는 방향족 시스템에 있어서 산 불안정성과 치환 입체 전자 간의 관계에 대해 기재한 문헌들을 통해 참조할
수 있다(예를 들면, Johnson, T., Quibell, M. and Sheppard, R. C.J. Pept. Sci.1, 11-25, 1995). 상기 에피토프-링
커 히드라존 결합이 1N HCl 또는 트리플루오로아세트산(TFA: trifluoroacetic acid)에 대해, 즉, 펩타이드 에피토프
에 불리한 영향을 끼치지 않는 비교적 온순한 조건에 불안정하며 가수분해 반응 및 상기 구조체(9)로부터 에피토프의
분석을 용이하게 하기 위해, 링커(8)의 오르쏘 및 파라 위치에 치환된 알콕시 타입의 치환체를 얻어야 한다.
알데히드 작용기(9)가 전자가 풍부한 방향족환에 결합되어 있는 전술한 구조체는, 결합하지 않은 캐리어의 흡광 및/
또는 형광 스펙트럼과 종 (9)과 종 (10)의 것을 비교함으로써, 적절한 pH 조건에서 구조체의 형성을 모니터링할 수
있다는 추가적인 이점이 있다. 특히, 이는 상기 방향족환이 pH의 변화에 의해 이온화되는 기로 치환된 것인 경우에
유용하다. 또한, 구조체 형성 반응을 모니터링할 수 있기 때문에, 상기 반응의 다양한 면, 예를 들면, 1종 이상의 활성
모이어티를 갖는 캐리어의 로딩 정도 등을 제어하는 것이 가능할 수 있다.
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발명의 상세한 설명
따라서, 본 발명의 일면은 하기 일반식(Ia 내지 Ie)으로 표시되고 양전하 균형을 이룬 링커(positive charge-balance
d linker), 또는 그의 염, 수화물, 용매 화합물(solvate), 착물(complex) 또는 전구약물(prodrug)을 제공한다:
(상기 일반식 Ia 내지 일반식 Ie에서,
X= O 또는 S이고;
Y는 O, S, CH 2 , CHR 또는 CRR(단, 각각의 R은 C 1-7의 알킬)이고;
Z는 O 또는 S이고;
R 1 은 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 2 는 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 4 는 상기 방향족환에서 임의의 빈 자리에 존재하는 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 3 는 C 1-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH, C 3-10의 사이클로알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH 또는
Ar-C 0-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH이되,
각각의 L 1 및 L 2 가 부재이거나, 각각의 L 1 및 L 2 가 아미드 CONH와 같은 적절한 링커이거나; 또는 에테르 -O
-, 티오에테르 -S-, 또는 설폰 -SO 2 -이고;
R 5는, R 5가 양전하를 함유하도록, 각각 NR 8R 9 (질소 원자가 용액 중에서 N HR 8R 9 를 제공하도록 프로
톤화될 수 있는 것), 또는 4급 질소 원자 N R 8R 9 R 10으로 치환된 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또
는 Ar-C 0-7의 알킬이고;
R 6는 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이며,
R 8, R 9 및 R 10은 각각 독립적으로 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이거나, 또는
R 8, R 9 및 R 10중 2종 이상이 함께 지방족환 또는 아릴지방족환 시스템을 형성하는 것임).
일반식 (I)의 화합물은 캐리어와 반응하여, 그 표면 전하 패턴이 실질적으로 원래의 캐리어 전하 패턴과 동일한, 유도
화된 캐리어를 형성할 수 있다. 상기 캐리어는 단백질일 수 있다. 상기 캐리어의 전하 패턴이 실질적으로 변화하지 않
기 때문에, 실질적으로 상기 단백질의 용해도를 저해하지 않으면서 단백질 캐리어 상의 활성 모이어티의 로딩 정도를
증가시킬 수 있다.
아울러, 상기 캐리어가 폴리머 표면 또는 유리 슬라이드인 경우에는 전하 균형을 포함하는 링커 유도화된 캐리어가
로딩된 활성 모이어티의 제공을 향상시킬 수 있는, 유리한 용매화 특성 및/또는 무질서 유발 효과(chaotropic effect)
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나타낼 수 있다.
이러한 용해도 증가와 더불어, 본 발명에 따른 전하 균형을 이룬 링커를 이용하여 형성된 구조체는 조절된 방법 및 화
학 선택적인 방법을 이용하여 활성 모이어티를 캐리어에 로딩하는데 이용될 수 있다는 이점이 있다. 로딩 정도는 구
조체의 용도에 적합하게 선택될 수 있으며, 또한, 분석 목적에 맞게 정량적으로 결정될 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 전하 균형을 이룬 링커를 이용하여 형성된 구조체가 갖는 다른 이점으로서, 로딩되지 않은 캐
리어, 링커 유도화된 캐리어 및 히드라존 유도화된 완전한 구조체 간의 흡광 및 형광 스펙트럼 차이를 분석하여, 모니
터링될 수 있다는 점을 들 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '헤테로원자'는 산소(O), 황(S) 및 질소(N)으로서 정의되며, '할로겐'은 플루오르(F), 염소(Cl) 및
브롬(Br)으로서 정의된다.
또한, 본 명세서에 사용된 'C 1-7의 알킬'이란, 1개 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 안정한 선형 또는 분지형 지방
족 포화 또는 불포화 탄소 사슬로서 정의되 며, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부
틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 헵틸 및 이들의 임의의 간단한 이성질체를 들 수 있다. 또한, 임의의 C 1-7 알킬은 선택
적으로 임의의 위치에서 1개, 2개 또는 3개의 할로겐 원자(전술한 바와 같이 정의된 것)로 치환될 수 있으며, 그 예로
서, 트리플루오로메틸 치환체를 들 수 있다. 아울러, C 1-7의 알킬은 1종 이상의 헤테로원자(전술한 바와 같이 정의
된 것)를 포함할 수 있으며, 그 예로서, 에테르, 티오에테르, 설폰, 설폰아미드, 치환 아민, 아미딘, 구아니딘, 카르복시
산, 카르복사미드를 들 수 있다. 헤테로원자가 사슬 말단에 위치하는 경우에는 1개 또는 2개의 수소 원자로 적절히 치
환되어 있다. 헤테로원자 또는 할로겐 원자는 C 1-7이 최소 2개의 탄소 원자를 포함하는 경우에만 존재한다.
본 명세서에 사용된 'C 3-10의 사이클로알킬'이란, 'C 1-7의 알킬'의 임의의 변형체를 포함하고, 부가적으로, 사이클
로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실과 같은, 3원 내지 6원(員)의 카르보사이클릭환을 포함하는 것
으로서 정의된다. 상기 카르보사이클릭환은 선택적으로 1개 이상의 할로겐 원자(전술한 바와 같이 정의된 것) 또는
헤테로원자(전술한 바와 같이 정의된 것)로 치환될 수 있으며, 그 예로서, 테트라하이드로퓨란, 피롤리딘, 피페리딘,
피페라진 또는 모르폴린 치환체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용된 'Ar-C 0-7의 알킬'이란, 부가적으로 방향족환 모이어티 'Ar'을 포함하는 'C 1-7의 알킬'의 임의
의 변형체를 포함하는 것으로서 정의된다. 상기 방향족환 모이어티 Ar은 안정한 5원 또는 6원의 불포화 모노사이클
릭환 또는 안정한 9원 또는 10원의 불포화 바이사이클릭환일 수 있다. 상기 방향족환 모이어티 Ar은 C 1-7의 알킬의
임의의 변형체에 의해 추가적으로 치환될 수 있다. 상기 Ar-C 0-7의 알킬에서 C=0인 경우에는 간단히 그 치환체가
방향족환 모이어티 Ar이 된다.
본 발명은 본 발명의 화합물의 모든 염, 용매 화합물, 착물 및 전구약물을 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 입체화학
적 중심의 모든 이성질체, 및 entgegen(E) 또는 zusammen(Z) 알켄과 같은 모든 이중 결합 이성질체, 및 syn 또는 an
ti 히드라존을 포함한다. 또한, 본 발명은 예를 들면, 14 C, 2 H, 17 O 및 15N과 같이, 탄소, 수소, 산소 및 질소의 동
위원소 등의 가장 일반적인 동위원소를 제외한 기타 동위원소와 포함하는 화합물을 포함한다.
본 발명에서, 용어 '활성 모이어티' 또는 '활성 모이어티들'이란, 에피토프, 미모토프(mimotope) 또는 리간드를 칭한
다. 본 발명에 있어서, 상기 활성 모이어티는 필요한 경우에, 화학 선택적 방법으로 일반식 (I)의 링커와 반응이 가능
하도록 유도화될 수 있다. 이러한 화학 선택적 반응에 적절한 유도체로서, 히드라지드 유사체가 포함된다. 상기 활성
모이어티가 펩타이드인 경우에는 리신의 측쇄 또는 N-말단 질소 또는 C-말단 카르복시산을 히드라지드를 제공하는
시약과 반응시킴으로써, 히드라지드로의 유도화 반응을 얻을 수 있다. 상기 활성 모이어티가 반응에 적합한 치환체를
포함하지 않아, 히드라지드와 같은 적절한 유도체를 제조할 수 없는 경우에는, 이러한 기, 예를 들면 아민기가 도입되
도록 개질할 수 있다. 예를 들어, Kochetkov 반응을 통해서 당 및 올리고당을 올리고당의 환원 말단에서 글리코실아
민으로 전환시킬 수 있다(Vetter, D. and Gallop, M. A.Bioconj . Chem . 6 , 316-318,1995). 상기 글리코실아민
은 트랜스-히드라진 분해 반응(trans-hydrazinolysis)에 의해 히드라지드로 전환될 수 있다(Prasad, A. V. N. and R
ichards, J. C. 국제특허9702277). 다른 예로서, 올리고핵산염은 특정 히드라지드 관능기를 포함하는 개질된 염기를
포함하도록 제조될 수 있거나(Strobel, H.et al,Nucl. Acids Res.30(9), 1869-1878,2002), 또는 2, 3 또는 5-프
라임 히드라지드 모이어티를 포함하도록 제조될 수 있다.
어떤 경우에는 캐리어에 1가지 타입 이상의 활성 모이어티가 결합될 수 있다.
용어 '에피토프'란, 항체, 항원 또는 세포 표면 수용체와 같은 생물학적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 칭
한다. 상기 에피토프는 탄수화물, 단백질 또는 펩타이드 분자, 또는 이러한 분자의 변형체 또는 유사체로부터 유래된
단편(fragment), 예를 들면, 항원 결정인자일 수 있다. 전술한 방법으로 이용될 수 있는 에피토프를 예시하면 옥시토
신 및 그의 유사체, B-세포 및 T-세포 에피토프, 및 박테리아와 같은 병원균에서 표면 올리고당으로부터 유래된 항원
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결정인자(antigenic determinant)를 들 수 있다.
'미모토프'는 에피토프의 활성을 모방한 합성 분자이다.
'리간드'는 수용체에 결합하여 반응을 유발할 수 있는 모이어티이다. 이러한 리간드는 펩타이드, 단백질, 당, 지질, 핵
산, 알칼로이드, 비타민 또는 소형 유기 분자일 수 있다. 예를 들면, 효소면역측정법(ELISA: enzyme-linked immuno
sorbent assay) 또는 기타 분석법에 이용되는 효소나, 상처 드레싱(wound dressing)에 이용하는데 적합한 펩타이드
성장 인자 또는 화학유인성 단백질(chemo-attractant protein)일 수 있다. 그 밖의 예로서, 리간드가 헤파린과 같은
단백질일 수 있다. 다른 실시예로서, 상기 리간드가 발색단(chromophore)(생화학적, 생물 물리학적 또는 화학적), 형
광단(fluorophore)(생화학적, 생물 물리학적 또는 화학적), 루미노포어(luminophore)(생화학적, 생물 물리학적 또는
화학적), 인광(phosphorescence), 방사화학물(radiochemical), 양자점(quantum dot), 전자 스핀 태그(electron spin
tag), 자성 입자(magnetic particle), 핵 자기 공명 태그, X선 태그, 마이크로파 태그, 전자물리학(예: 증가된 저항), 표
면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 열량계 등과 같은 표지화 분자(labelling molecule)일 수 있다.
'캐리어'는 접합 반응을 통해 적절히 유도화된 에피토프와 반응하는 복수 개의 활성 부위를 포함하는 단백질성 분자일
수 있다. 본 발명에 적절한 캐리어 단백질을 예시하면, BSA(bovine serum albumin), 오브알부민 및 KLH(keyhole li
mpet haemocyanin), 열 충격 단백질(HSP: heat shock protein), 티로글로불린(thyroglobulin), 면역 글로불린 분자,
파상풍 톡소이드, PPD(purified protein derivative), 아프로티닌(aprotinin), HEWL(hen egg-white lysozyme), 탄
산 탈수효 소(carbonic anhydrase), 오브알부민, 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 홀로-트랜스페린(holo-transf
errin), 인산화효소 B(phosphorylase B), β-갈락토시다아제, 마이오신(myosin), 박테리아 단백질 및 동 기술 분야
에 공지된 기타 단백질을 들 수 있다. 또 다른 실시예로서, 상기 캐리어는 코폴리머 및 약간의 비타민과 알칼로이드를
포함하는 다당류 (세파로오즈, 아가로오즈, 셀룰로오즈), 셀룰로오즈 비드, 폴리머성 아미노산과 같은, 서서히 대사된
대형의 매크로분자(macromolecule)로부터 선택될 수 있다. 활성 모이어티를 제공하는 캐리어로서, 비활성 바이러스
입자(예를 들면, B형 간염 바이러스의 핵심 항원에 대한 Murray, K. and Shiau, A-L.,Biol . Chem 380 , 277-28
3,1999참조) 및 살모넬라균과 같은 약독화 박테리아(attenuated bacteria) 역시 이용될 수 있다.
고형의 지지된 용도에 있어서는 용어 '캐리어'를 수지 비드, 플라스틱 시트 또는 유리 슬라이드 등의 비가용성 폴리머
의 의미로 적용할 수 있다.
본 발명의 어떤 면에 있어서는, 용어 '리간드' 및 '캐리어'는 '리간드'와 '리간드' 및/또는 '캐리어'와 '캐리어'의 결합에
적용되도록, 그 의미상 상호 변통될 수 있다.
'접합체(conjugate)'란, 화학적으로 비특이적인 방법에 따라 에피토프를 캐리어 단백질에 결합시킬 수 있는 분자를 칭
한다.
'링커'는 화학 선택적인 방법(다관능성기를 포함하는 화합물 내의 단일 작용기에서 선택적으로 반응함)에 따라 캐리
어, 및 에피토프와 같은 활성 모이어티와를 결합시키기 위해, 전술한 캐리어와 활성 모이어티의 특이적 화학 반응을
수행할 수 있는 분자를 칭한다.
'구조체'란, 링커 또는 접합체를 통해 복수 개의 활성 모이어티와 결합된 캐리어를 칭한다.
'전하 균형을 이룬 링커(charge balanced linker)'란, 캐리어와 반응 시에 상기 캐리어의 전체 표면 전하 패턴이 근본
적으로 변화하지 않도록 하전된 링커이다.
'양전하 균형을 이룬 링커'란, 양전하를 포함하며 전하 균형을 이룬 링커이다.
일반식 (I)의 화합물로서, 하기 조건이 독립적으로 또는 임의의 조합으로 충족되는 것이 바람직하다:
X가 산소;
Y가 산소;
R 1 이 수소, 메틸 또는 에틸이며, 특히 적합하게는 수소;
R 2 가 수소 또는 C 1-4 의 알킬, 더욱 바람직하게는 R 2 가 수소, 메틸 또는 에틸이고, 특히 수소 또는 메틸, 가장 바
람직하게는 수소;
L 1 이 아미드 CONH; 및
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L 2 가 아미드 CONH.
R 3 의 정의에 있어서, R 5의 양전하성 질소 원자는 방향족환의 전자의 이동을 방해하지 않도록 하여, 카르보 양이
온(12)을 공명 안정화하도록 하기 위해, 방향족환으로부터 적절한 거리를 두고 위치해야 할 필요가 있다. 아울러, 쉽
게 적용할 수 있는 개시 반응제로부터의 합성 및 R 5의 결합을 용이하게 하기 위해, 일반식 (Ⅱ)에서 바람직한 R 3
치환체는 간단한(즉, 불포화) 선형 사슬 알킬기 또는 간단한 사이클로알킬기 또는 카르복시산을 포함하는 간단한 방
향족으로부터 선택된다. R 3 로서 특히 적절한 사이클로알킬기는 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실 모이어티를 포함
하는 것으로서, 상기 방향족기를 예시하면 페닐, 알킬페닐(예: 벤질), 또는 페닐알킬을 들 수 있다. 적절한 R 3 기를
구체적으로 예시하면, 하기 화학식으로 표시되는 것을 들 수 있다:
(화학식)
(상기 화학식에서, n= 2∼6, m= 1∼3임).
R 5의 바람직한 정의는 가능한 한 단백질 표면 리신 잔기와 유사한 성질을 갖도록 고안된 양전하성 질소 원자이다.
아울러, 적용하기 용이한 개시 반응제로부터 일반식 (I)에 기재된 구조체 내에 R 5의 결합을 용이하게 하기 위해서,
상기 치환체 NHR 5 CO(단, NH가 상기 L 1 모이어티의 일부이며, CO가 상기 L 2 모이어티의 일부임)가 프로톤화
가능한 아민 작용기 측쇄를 함유하는 간단한 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, NHR 5 CO는 링커(8)를 통해 직접 캐리어 단백질이 전하 균형을 이루도록 한 아미노산 잔기로서 정의되는 것
이 바람직하다. 따라서, 로딩량이 높고 가용성의 양전하 균형을 이룬 링커-캐리어 단백질(9)은 R 5내에 보호된 아민
작용기의 첨가 반응을 통해 잠재된 아민 작용기를 포함하며 전술한 용해도 저하 문제를 극복할 수 있는 중간 구조체(
9)를 제공할 수 있다.
NHR 5 CO로서 적절한 아미노산 잔기는 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
(화학식)
(상기 화학식에서,
p는 1 내지 5(바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 내지 3)이고,
R 8, R 9 및 R 10은 전술한 바와 동일하게 정의됨).
합성을 용이하게 하고, 입체 장애 문제가 유발되는 것을 방지하기 위해서는 각각의 기 R 8, R 9 및 R 10이 C 1-4 의
알킬을 포함하는 것이 바람직하고, 특히, 메틸이 바람직하다.
R 3 의 정의에 있어서, 치환체 R 6는 스페이서로서 정의되며, 양전하 균형을 이룬 링커-캐리어 단백질(9)의 형성에
앞서, 링커(8)의 순조로운 활성화 반응이 가능하도록 하는데 필요하다. 이는 우레탄 보호되지 않은 아미노산의 활성화
반응을 통해 C α -키랄 중심을 라세미화 하는 펩타이드 화학 기술 분야에 공지된 바와 같다(예를 들면, Benoiton, N.
L. and Kuroda, K.Int J. Pept . Prot . Res.17, 197, 1981를 참조). 또한, 측쇄 보호되지 않은 아미노산(R 5로서
바람직함)의 활성화 반응에는 특별한 조건이 요구되며, 종종 원치 않는 부반응을 야기하는 펩타이드 화학 기술 분야
에 공지된 것도 참조할 수 있다. 이 같은 문제점을 고려할 때, 스페이서 R 6은 전술한 바와 같은 잠재적인 어려움을
해소하여, 쉽게 활성화된 카르복시산 작용기를 제공해야 할 필요가 있다.
R 6는 상기 L 2 모이어티로부터 유래된 NH기 및 말단 COOH와 결합하여 하기 화학식으로 표시되는 아미노산 잔기
를 형성하는 것이 바람직하다:
(화학식)
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(상기 화학식에서,
q 및 r이 각각 0 내지 3이되, q 및 r이 둘 다 0은 아니며;
s는 0 또는 1이고;
A는 5 내지 10원의 안정한 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족환이거나, 또는 3 내지 6원의 카르보사이클릭 또
는 지환식환임).
상기 화학식에서, r이 0이고 q가 1 또는 2인 것이 더욱 바람직하다.
링커(8)의 합성을 용이하게 하기 위해, 적용하기 용이한 개시 반응제로부터 반응을 개시하는 경로를 따르는 것이 바
람직하다. 이에 따라, 일반식 (Ia)로 표시되는 화합물이 바람직하며, 특히, 일반식 (Ⅱ)에 정의된 바와 같은 2,4-디알
콕시 치환된 벤즈알데히드 중에서 고안된 링커가 바람직하다:
(일반식 (Ⅱ))
(상기 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물은, X 및 Y가 O이고, R 1 이 H이며, R 2 및 R 3 가 전술한 바와 같이 정의되는
일반식 (Ia)의 화합물임).
일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물의 더욱 바람직한 구현예로서, 구체적으로는 하기 일반식 (Ⅲ)으로 표시되는 화합물을
들 수 있다:
(일반식 (Ⅲ))
(상기 일반식 (Ⅲ)에서,
o는 2 내지 6의 정수이고;
p는 1 내지 5의(바람직하게는 1 내지 4, 또는 더욱 바람직하게는 1 내지 3의) 정수이고;
R 6, R 8, R 9 및 R 10은 전술한 바와 동일하게 정의됨).
일반식 (Ⅲ)의 구현예로서, 조합 NH-R 5 CO(상기 화학식에서, NH는 상기 L 1 모이어티의 일부를 형성하고, CO는
상기 L 2 모이어티의 일부를 형성함)는 4급 질소 원자를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산 잔기로 표시된다. 따라서, 이
NH-R 5 CO기는 R 6에 결합된 카르복시산과 반응하는 캐리어 단백질 상에 존재하는 상기 전하의 측쇄 리신을 대신
신할 수 있다.
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일반식 (Ⅲ)의 보다 더욱 바람직한 구현예로서, 하기 일반식 (Ⅳ)로 표시되는 화합물을 제공한다:
(일반식 (Ⅳ))
(상기 일반식 (Ⅳ)에서,
R 10= Me 또는 R 10= '='이고,
상기 질소는 프로톤화 반응에 의해 4급화 될 수 있음).
일반식 (I)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (I)에서, L 1 및 L 2 가 CONH임)은 용액상 또는 고상 합성될 수 있다. 일반
식 (I)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (I)에서, L 1 및 L 2 가 CONH임)은 하기의 단계를 수행함으로써 고상 합성될 수
있다:
(ⅰ) 하기 일반식 (Ⅴ)로 표시되며, 그의 C-말단이 고체 지지체에 결합된 화합물을, 하기 일반식 (Ⅵ)으로 표시되는 화
합물과 반응시키는 단계:
(일반식 (Ⅴ))
(상기 일반식 (Ⅴ)에서,
R 6는 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일함),
(일반식 (Ⅵ))
(상기 일반식 (Ⅵ)에서,
R 5는 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
W는 보호기임);
(ⅱ) 보호기(W)를 제거하고, 일반식 (Ⅶ)로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계:
(일반식 (Ⅶ))
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(상기 일반식 (Ⅶ)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 는 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
R 11 은 C 1-7의 알킬-COOH, C 3-10의 사이클로알킬-COOH 또는 Ar-C 0-7의 알킬-COOH임); 및
(ⅲ) 상기 고체 지지체로부터 생성물을 제거하는 단계.
전술한 고상 합성법에 이용하는데 적절한 고체 지지체로서는 2-클로로트리틸 수지와 같은, 펩타이드 카르복시산의
합성에 적합한 임의의 수지가 포함된다. 클로로트리틸 수지는 상기 생성물을 산, 이를테면, 디클로로메탄과 같은 극성
유기 용매 내의 트리플루오로아세트산으로 처리함으로써 제거될 수 있다.
상기 보호기(W)는, 상기 보호기를 디메틸포름아미드 내의 피페리딘을 이용하여 처리함으로써 얻는 경우에 제거가 가
능한 우레탄 보호기, 예를 들면, Fmoc와 같 은 기이다(참조: 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 보호법에 따른 고
상 합성법에 대한 기술로서, Atherton, E and Sheppard, R. C. in 'Solid Phase Peptide Synthesis: A practical App
roach', IRL Press,1989).
다른 구현예로서, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물은 동 기술 분야에 공지된 통상의 고상 펩타이드 화학에 따라, 일반
식 (Ⅴ), 일반식 (Ⅵ) 및 일반식 (Ⅶ)로 표시되는 화합물로부터 제조될 수 있다.
일반식 (Ⅴ), 일반식 (Ⅵ) 및 일반식 (Ⅶ)로 표시되는 화합물은 적용하기 용이하며, 동 기술 분야의 당업자들에게 잘 알
려져 있다.
통상적으로는 무엇보다도 아미노산 반응제를 쉽게 적용할 수 있다는 점 때문에, 상기 L 1 이 아미드 CONH이고 상기
L 2 가 아미드 CONH인 것이 바람직하다. 그러나, 이를테면, 하기 일반식 (Ⅷ)로 표시되는 화합물을 통해, 링커를 포
함하는 비 아미드 L 1 및 L 2 역시 화학 선택적이며, 성질 조절이 가능하고 전하 균형성을 제공할 수 있다:
(일반식 (Ⅷ))
.
용액상 및 고상에서의 에테르, 티오에테르 및 설폰을 합성하는 통상적인 합성법은 동 기술 분야의 당업자들에게 공지
되어 있다(예를 들면, (a) 아미노산의 α-하이드록시산으로의 전환에 대한, Degerbeck, F.et al,J. Chem . Soc , P
erkin Trans.1, 11-14,1993; (b) 아미노산의 α-브롬산으로의 전환에 대한, Souers, A. J.et al,Synthesis, 4, 5
83-585,1999; (c) 고상 합성법에 대한, Grabowska, U.et alJ. comb. Chem., 2(5), 475-490,20 0을 참조).
공개특허 10-2005-0007454
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예를 들어, α-하이드록시산을 소듐 하이드라이드 및 알킬 할라이드로 처리하면 에테르를 얻을 수 있다. 다른 구현예
로서, α-브롬산을 알킬 티올로 처리하면 티오에테르를 얻을 수 있다. 티오에테르는 쉽게 산화되어 설폰을 제공할 수
있다. 이러한 염기성 화학 반응물의 조합을 이용하여 일반식 (Ⅷ)로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다. 그 예로서, 도식
6은 일반식 (Ⅷb)로 표시되는 화합물의 합성을 나타낸다:
(도식 6) L 1 = 티오에테르 'S' 링커의 제조
.
아미노산(Ⅸ)을 소듐 나이트라이트 / H 2 SO 4 / 포타슘 브로마이드를 이용하여 처리하는 경우에는 배치가 유지된
α-브롬산(Ⅹ)(Souers, A. J.et al,Synthesis, 4, 583-585,1999)을 얻을 수 있다. 카르복시산 활성화된 α-브롬
산(Ⅹ)을 카르복시산 보호된 글리신(XI)의 유리 아미노산에 결합시킴으로써, 블록(XII)을 형성할 수 있다. 동 기술 분
야의 당업자들에게 공지된 통상의 카르복시산 보호기로서는 tert-부틸 에스테르를 이용할 수 있고, 고상 합성법에서
는 2-클로로트리틸 에스테르와 같은 기를 이용할 수 있다. 염기 촉매 하에서의 티올(XIII)을 이용한 브로마이드(XII)
의 친핵성 치환 반응은 배치가 역전되면서 진행된다. 또한, 카르복시산 보호기를 제거(예를 들면, 'PG'= tert-부틸 에
스테르인 95%의 트리플루오로아세트산 수용액)함으로써, 일반식 (Ⅳ)로 표시되는 화합물과 동일한 방법으로 이용될
수 있는 링커(Ⅷb)를 얻을 수 있다. 전술한 바와 같이, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합 물은 에피토프와 같은 활성 모이
어티를 캐리어, 이를테면, 단백질에 결합시키는데 유용하다.
따라서, 본 발명의 다른 면은 하기 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물을 제공한다:
(일반식 (XIV))
(상기 일반식 (XIV)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 는 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
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R 12는 C 1-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONHQ, C 3-10의 사이클로알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONHQ 또
는 Ar-C 0-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONH-Q이되,
L 1 , L 2 , R 5및 R 6는 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
Q는 캐리어의 일부인 잔기이고, R 12의 'NH' 모이어티가 유래된 기를 포함하 거나, 또는 상기 기를 포함하도록 유도
된 것이며;
상기 캐리어는 0, 1, 2, …nn개의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커 분자가 부착되어 있는 복수 개의 Q 잔기를 포함할 수
있으며; nn은 링커 분자를 특정 캐리어에 부착하는데 이용 가능한 Q 잔기의 총 개수이고, 각각의 특정 캐리어에 대해
서로 상이할 수 있음).
상기 캐리어는 단백질성 분자일 수 있고, 이 경우에 R 12의 Q 및 NH 모이어티는 리신 측쇄로부터 유래될 수 있다.
적절한 캐리어 단백질은 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 오브알부민, 열 충격 단백질(HSP), 티로글로
불린, 면역 글로불린 분자, 파상풍 톡소이드, PPD(purified protein derivative), 아프로티닌, HEWL(hen egg-white
lysozyme), 탄산 탈수효소, 오브알부민, 아포-트랜스페린, 홀로-트랜스페린, 인산화효소 B, β-갈락토시다아제, 마
이오신, 박테리아 단백질, 비활성 바이러스 입자(B형 간염 바이러스의 핵심 항원에 대한 Murray, K. and Shiau, A-L
.,Biol . Chem, 380 , 277-283,1999참조) 및 동 기술 분야에 공지된 기타 단백질을 들 수 있다.
비 단백질 캐리어로서는 다당류 (세파로오즈, 아가로오즈, 셀룰로오즈), 셀룰로오즈 비드, 폴리머성 아미노산, 코폴리
머 및 비활성 바이러스 입자가 포함되며, 살모넬라와 같은 약독화 박테리아 역시, 활성 모이어티를 제공하는 캐리어
로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서, 전술한 바와 같은 일반식 (Ⅰ)
로 표시되는 화합물을 단백질과 같은 캐리어와 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 반응은 수성 용매 내의 캐리어 용액 또는 현탁액을 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물 또는 그의 유도체를 반응시킴
으로써, 예를 들면, 15 내지 50℃의 온도, 바람직하게는 실온 조건에서, 디메틸 설폭사이드와 같은 용매 내에서, 숙신
이미드 에스테르, 대칭형 또는 비대칭형 무수물, 말레이미드, 또는 산 플루오라이드 또는 클로라이드, 펜타플루오로페
놀 에스테르, 또는 동 기술 분야에 공지된 기타 활성 에스테르를 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 상기 반응은 7보다 큰
pH 조건 하에서 유도될 수 있다.
일반식 (XIV)로 표시되는 화합물은 에피토프 또는 리간드와 같은 유도화된 활성 모이어티에 결합되기 위한 것으로,
본 발명의 다른 면은 하기 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 제공한다:
(일반식 (XV))
(상기 일반식 (XV)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 가 일반식 (Ⅰ)에 정의된 바와 동일하고;
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R 12는 일반식 (XIV)에 정의된 바와 동일하고;
R 13 은 (CH 2 ) t CONH-E, CONH-E 또는 G이되,
t는 1 내지 5의 정수이고;
E는 아미노기를 포함하거나 아미노기를 포함하도록 유도된 활성 모이어티로부터 유래된 것이고;
NHE는 활성 모이어티의 아미노기로부터 유래된 것이며;
G는 탄소 원자를 통해 카르보닐히드라지드에 결합된 활성 모이어티임).
E가 펩타이드 활성 모이어티로부터 유래된 경우에는 그 아미노기가 측쇄 리신 또는 N-말단 아민으로부터 유래된 것
일 수 있다.
일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 2개 이상의 활성 모이어티로부터 유래된 기(group)인 E 및/또는 G를 포함할 수 있
다. 상기 화합물은 특히 항체를 에피토프 또는 미모토프에 대해 증가시키는 것, 예를 들면, T-세포 및 B-세포 에피토
프 둘 다 각각의 캐리어 단백질에 접착될 수 있는 경우, 또는 항원보강제(adjuvant)를 캐리어에 결합시킬 수 있는 경
우, 또는 프로브(probe) 또는 마커(marker)를 둘 다 캐리어에 결합시킬 수 있는 분석적인 방법 등의 용도에 적용하는
데 유용할 수 있다.
일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 하기 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물들로부터 간단히 제조되고, 본 발명의 또 다
른 면은 전술한 바와 같은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서, 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물을 하
기 일반식 (XVIa), 일반식 (XVIb) 또는 일반식 (XVIc)로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 제공
한다:
(상기 각각의 일반식에서, E, G 및 t는 전술한 바와 동일함).
상기 반응은 15 내지 50℃의 온도, 바람직하게는 실온의 온도 조건 하에 수성 또는 친핵성 유기 용매 내에서 수행될
수 있다.
일반식 (XVIa)로 표시되는 화합물은, 일반식 (XVIIa)로 표시되는 화합물과 함께 에피토프 리신 잔기의 측쇄 또는 N-
말단 아민기 사이에서의 화학 선택적인 반응(복수 개의 작용기를 포함하는 화합물 내의 단일 작용기에서의 선택적인
반응)에 의해 에피토프와 같은 활성 모이어티로부터 제조될 수 있다:
(일반식 (XVIIa))
HOOC-(CH 2 ) t CONHNH-J
(상기 일반식 (XVIIa)에서,
t는 전술한 바와 동일하게 정의되며, J는 Boc(tert-부톡시카르보닐) 또는 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐)와
같은 보호기임).
상기 (XVIIa)로 표시되는 화합물의 카르복시산은 숙신이미드 에스테르와 같은 대칭형 또는 비대칭형 무수물, 말레이
미드, 또는 산 플루오라이드 또는 클로라이드, 펜타플루오로페닐 에스테르, 또는 당업계에 공지된 기타 활성 에스테르
로 활성화되며, 에피토프 리신 잔기의 측쇄 또는 N-말단 아미노기와 반응한다. 에피토프 리신 잔기의 측쇄 또는 N-
말단 아민기와 일반식 (XVIIa)와의 화학 선택적인 반응을 통해, 단일의 유리 측쇄 리신 잔기 또는 N-말단 아민기를
포함하며 완전히 보호된 에피토프(측쇄 보호법에 대한 설명에 있어서, Atherton, E and Sheppard, R. C. in 'Solid P
hase Peptide Synthesis: A Practical Approach', IRL Press,1989를 참조)를 얻을 수 있다. 단독의 유리 측쇄 리신
잔기 또는 N-말단 아민기를 포함하는, 기타 완전히 보호된 에피토프는 당업계에 공지된 통상의 고상 펩티드 합성법,
또는 통상의 용액상 펩티드 합성법에 따라 제조될 수 있다.
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다른 구현예로서, 일반식 (XVIa)로 표시되는 화합물은 글리코실아민과 같은 활성 모이어티로부터, 이를테면, 하기 일
반식 (XVIIIa)로 표시되는 디히드라지드 화합물에 의한 아민의 화학 선택적인 친핵성 치환 반응을 통해 제조될 수 있
다:
(일반식 (XVIIIa))
H 2 NNHCO(CH 2 ) t CONHNH 2.
일반식 (XVIb)로 표시되는 화합물은 전술한 바와 동일한 방법으로 글리코실아민과 같은 활성 모이어티로부터, 예를
들면, 하기 화학식 (XVIIIb)로 표시되는 카르보닐 디히드라지드 화합물에 의한 아민의 화학 선택적 친핵성 치환 반응
을 통해 제조될 수 있다:
(일반식 (XVIIIb))
H 2 NNHCONHNH 2 .
일반식 (XVIc)로 표시되는 화합물은 카르보닐히드라지드를 유기 분자에 도입하기 위한 당업계에 공지된 다양한 방법
에 따라서, 활성 모이어티로부터 제조될 수 있다.
일반식 (XVa-e), 일반식 (XVIa) 및 일반식 (XVIIIa)로 표시되는 화합물에서, -(CH 2 ) t -기가 바람직하기는 하지만,
C 1-7의 알킬기, C 3-10의 사이클로알킬기 또는 Ar-C 0-7의 알킬기로 대체될 수 있다.
캐리어에 대한 활성 모이어티의 조절된 접합법에 있어서, 특별한 예를 들어 기재한 상기 기법은 용액상 및 고상 지지
체 모두에서 다양하게 적용된다. 특히, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 의학 용도에 유용하기 때문에, 본 발명은 의
약용으로서 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 또한 제공한다. 의약용은 치료 또는 진 단을 목적으로 하는 것일 수 있
다. 활성 모이어티 E 또는 G가 치료제인, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 적절한 의학 상태를 치료하는데 이용될
수 있다. 다른 구현예로서, E 또는 G가 항원인 경우에는, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물이 백신으로서 유용할 수 있
다. 또한, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 다양한 진단 용도, 예를 들면, 고상 또는 용액상 분석법에 이용될 수 있다.
이러한 용도를 예시하면 하기와 같은 용도를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
용액상 적용
본 발명의 조성물을 이용하여, 캐리어(예를 들면, 펩타이드, 단백질, 당, 지질, 핵산 등이 있으나, 이에 제한되지 않음)
를 리간드(예를 들면, 펩타이드, 단백질, 당, 지질, 핵산, 알칼로이드, 비타민, 소형 유기 분자 등을 들 수 있으나, 이에
제한되지 않음)에 화학적으로 결합시키는 경우.
따라서, 본 발명의 다른 면은 수용액에서 가용성을 나타내며, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 제공한다.
본 발명의 용액상 적용은 하기의 경우를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
에피토프 / 미모토프를 단백질과 같은 캐리어에 접합하는 경우
(실시예 1 내지 실시예 5를 참조)
활성 모이어티가 에피토프 또는 미모토프인 경우에는 상기 활성 모이어티가 단백질 또는 펩타이드 분자, 또는 이러한
분자의 변형체 또는 유사체로부터 유래된 단편 예를 들면, 항원 결정인자, 또는 탄수화물로부터 단편, 예를 들면, 박테
리아 와 같은 병원균으로부터 유래된 표면 다당류를 들 수 있다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 에피토프 및 미모
토프를 예시하면 옥시토신 및 그의 유사체를 들 수 있다. 상기 캐리어는 대부분의 경우에 있어서 단백질일 수 있다.
본 발명은 에피토프/미모토프-캐리어 접합체의 용해성을 유지하면서, 고농도의 에피토프/미모토프를 캐리어 상에 로
딩할 수 있기 때문에, 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 접합 반응은 제어된 반응이기 때문에, 1개보다 많은 시약이
캐리어와 결합할 수 있어, 단독의 또는 복수 개의 면역적으로 상관이 있는 에피토프/미모토프(예를 들면, B-세포 및
T-세포 에피토프/미모토프)의 전달을 가능하게 한다. 또한, 에피토프/미모토프의 접합 반응은 면역조절 화합물(예를
들면, 지질, 항원보강제, 면역자극성 DNA 서열, 사이토카인(cytokine) 등)의 공동 접합체와 결합할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 면으로서, 본 발명은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)에서, E 또는 G가 에피
토프 또는 미모토프로부터 유래됨)을 제공한다.
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선택적으로, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 또 다른 활성 모이어티, 예를 들면, 상기 캐리어에 결합된, 지질, 항원
보강제, 면역자극성 DNA 서열 또는 사이토카인과 같은 면역조절 화합물을 포함한다.
전술한 바와 같은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)에서, E 또는 G가 에피토프 또는 미모토프로부터
유래됨)은, 에피토프 또는 미모토프에 대항하는 특정 항체를 증가시키는 방법으로서, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물
을 이 용하여 대상을 면역시키는 단계를 포함하는 방법에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 에피토프 또는 미모토프에 대한 항체 증가를 위해 대상을 면역시키기 위한 화합물로서, E 또
는 G가 에피토프 또는 미모토프로부터 유래된, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 제공하고, 또한, 에피토프 또는 미
모토프에 대한 항체 증가용 약제의 제조에 이용되는 일반식 (XV)의 화합물의 용도를 제공한다.
일반식 (XV)로 표시되는 면역성 화합물은 백신으로 유용하기 때문에, 본 발명의 다른 면은 E 또는 G가 에피토프 또는
미모토프로부터 유래된 일반식 (XV)로 표시되는 백신용 화합물, 및 E 또는 G가 에피토프 또는 미모토프로부터 유래
되고 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 백신 조성물일 수 있으며, 추가로 약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 포함할 수 있다.
일반식 ( Ⅰ ) 로 표시되는 링커 (예를 들면, TML (14))과 단백질의 반응에 대한 분광학적 특성
(실시예 6 참조)
통상의 간접법 및 직접법에 따라 단백질의 농도를 결정하였다. 가장 간단한 간접법은 단백질과 색소균의 반응(Gornal
l,et . al., (1949),J. Biol . Chem .,147, 751; Lowry,et . al ., (1951),J. Biol . Chem ., 193, 265; Bradford, (
1976),Anal. Biochem ., 248, 72; Smith,et . al ., (1985),Anal. Biochem ., 150, 76) 또는 형광 시약과의 반응(
Haugland, R. P., (2002),Handbook of fluorescent probes and research chemicals, Mole ular Probes, Inc., E
ugene, OR, USA)에 따른다. 실행 시에는 사실상, 단백질과 결합 시에 발색 특성을 나타내는 염료 반응제와 단백질을
반응시킴으로써, 또는 단백질과 특정 반응제의 유도화 반응을 통해 수행되어 왔다. 통상적으로 간접법은 특성을 파괴
하며, 단백질 샘플을 회복하는 것이 쉽지 않다. 반면, 직접법은 특정 아미노산, 통상적으로는 페닐알라닌, 티로신 및/
또는 프립토판, 및/또는 펩타이드 결합의 존재로 인해 나타나는 흡광 스펙트럼을 측정함으로써 수행된다. 전술한 직
접법은 비교적 간단하며, 비파괴적이어서 단백질 샘플을 회복시킬 수 있다. 임의의 보결 원자단(prosthetic group)의
부재 시에 모노머(아미노산) 또는 폴리머(펩타이드 또는 단백질) 중 하나로서의 아미노산의 흡광 스펙트럼은 근본적
인 아미노산의 성질 때문에 300 ㎚ 미만의 파장으로 제한된다(Teale and Weber, (1957),Biochem . J.65 476-48
2). 이는 단백질의 스펙트럼 특성이 통상적으로 300 ㎚ 미만의 파장에서 나타나며, 단백질 캐리어와 일반식 (Ⅰ)로 표
시되는 링커의 반응을 모니터링할 수 있음을 의미한다. 중성의 pH 또는 중성보다 낮은 pH에서 일반식 (Ⅰ)로 표시되
는 링커(단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 가 H이고 X가 O임, 예: TML 링커(14))는 300 ㎚보다 큰 파장에서 최소의 흡광도를
나타내나, pH 수치가 중성 pH 수치보다 높아질수록 페녹사이드 종의 하이드록시기가 이온화됨으로써, 상기 링커는
고염색 스펙트럼 특성을 나타내게 된다. 이러한 고염색 이동은 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커가 단백질과 반응하는 경
우(예를 들면, BSA-TML(예: 일반식 (XIVa)로 표시되는 화합물)을 형성하는 TML 링커와 BSA의 반응)에 는 유지된
다. 300 ㎚보다 큰 파장에서의 아포-단백질의 작은 흡광도와 함께 이 같은 스펙트럼 특성으로 인해, 단백질에 대한
상기 링커의 반응도(즉, 링커 로딩)를 모니터링할 수 있고, 그 반응도를 흡수 스펙트럼, 이를테면, 376 ㎚의 파장으로
부터 직접 정량화할 수 있다(도 12의 BSA-TML 종에 대한 스펙트럼 분석을 참조). 형광 시약인 Fluram을 이용하는
방법과 같이, 단백질 유도화 정도를 분석하기 위해 현재 이용되는 방법에 비해 전술한 분석 방법은 확실히 개선된 것
이다(실시예 2 및 도 1 참조). 이러한 흡광법은 실험적인 방법론에 따르며 파괴적인 Fluram법에 비해, 간단하고도 비
파괴적인 방법이다.
아울러, 300 ㎚보다 큰 파장(예: 약 375 ㎚)에서의 여기(excitation) 시에, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커(단, 일반식 (
Ⅰ)에서, R 2 = H, X= 산소)를 이용하여 유도화된 단백질(예를 들면, BSA-TML)은 발광성을 나타낸다(도 13 참조).
따라서, 이러한 형광 스펙트럼을 이용하여, 상기 링커와 단백질 간의 반응 과정을 모니터링 할 수 있다.
최종 유도화 정도 외에도, 흡광 스펙트럼 또는 형광 스펙트럼을 측정함으로써 비파괴적인 방법에 의해, 일반식 (Ⅰ)로
표시되는 링커(단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 = H, X= 산소)(예를 들면, TML 링커(14))와 단백질(예: BSA)의 유도화율을
분석할 수 있다. 이들의 커플링 반응이 개시된 이후에는 분석용 샘플을 제거하고, 신속하게 처리하여 상기 링커-단백
질 종을 미반응 링커로부터 분리할 수 있다(처리법은 몇 분 이내에 실험적으로 분리 공정을 수행하는 데 적합한 방법)
. 그런 다음, 전 술한 바와 같이 분리한 링커-단백질 종의 흡광 스펙트럼 측정(농도는 Beer-Lamberts 법칙에 따라,
보정 곡선을 작성하여 계산할 수 있음; Atkins, (1984),Physical Chemistry, Second Ed., Oxford University Pres
s, Oxford, UK) 또는 형광 스펙트럼 측정을 통해, 상기 종을 정량화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 면은 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커(단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 = H, X= O)와 단백질의 반응 정
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도 및/또는 반응 속도를 정량화하기 위한 비파괴적인 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)의 형성 여부를 검사하기 위해, 30
0 ㎚보다 큰 파장 및 7보다 높은 pH에서 흡광 스펙트럼의 강도를 측정하는 단계; 또는
b) 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)의 형성 여부를 검사하기 위해, 선
택된 파장에서 여기 시의 형광도를 측정하는 단계.
전술한 방법을 상기 반응 속도의 측정 시에 이용하는 경우, 시간에 따른 흡광 스펙트럼 강도 또는 형광 강도의 변화를
계산하여 생성물 형성률을 결정할 수 있도록 하는 복수 개의 측정 단계가 포함될 수 있다.
전술한 방법은 통상적으로 실온(약 18 내지 25℃) 및 약 7 내지 11의 pH, 더 일반적으로는 7 내지 9.5의 pH 조건 하
에서 수행된다.
상기 흡광 스펙트럼은 300 내지 400 ㎚ 범위, 통상적으로는 약 350 내지 400 ㎚ 범위의 파장에서 측정될 수 있다.
상기 형광도를 측정하기 위해서는 여기 파장이 통상 300 내지 400 ㎚인 것이 적절하며, 바람직하게는 약 375 ㎚이다
.
단백질 구조체 ( XV )의 제공을 위한 리간드의 링커 -단백질(XIV)에 대한 화학 선택적 첨가 반응의 분석적 평
가.
(실시예 7 및 실시예 8 참조)
본 발명의 링커는, 일반식 (XIVa)로 표시되는 화합물을 제공하며 넓은 범위의 분자량(∼6.5 kDa 내지 205 kDa)을 갖
는 소스(예: 바이러스, 세균, 포유류 등)로부터 유래된 각종 세트의 단백질과 화학 선택적으로 반응할 수 있다.
화합물(15)와 같은 카르복시산 활성화 유사체를 이용하여, 일반식 (Ⅰ)의 전하 균형을 이룬 링커(예: TML 링커(14))
와 함께 표지화될 수 있는 단백질은 광범위한 분자량을 포함한다. 이러한 단백질을 예시하면, 아프로티닌(6.5 kDa),
HEWL(14 kDa), B형 간염 바이러스 코어 델타 항원(17 kDa), 탄산 탈수효소(29 kDa), 오브알부민(45 kDa), 소 혈청
알부민(66 kDa), 아포-트랜스페린(88 kDa); 홀로-트랜스페린(88 kDa); 인산화효소 B(97.4 kDa), β-갈락토시다아
제(116 kDa) 및 마이오신(205 kDa)를 들 수 있다.
일반식 (XIV)로 표시되는 각각의 화합물은, 바이오틴-히드라지드, 텍사스 레드(Texas Red)-히드라지드 및 옥시토
신-히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지 않는 한 세트의 히드라지드와 추가적으로 화학 선택적인 제어 반응을 수
행하여, 일반 식 (XVa)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XVa)에서, R 13 은 (CH 2 ) t CONHE 또는 G임)을 제공할 수
있다. 이 같은 적용은, 단백질과 활성화 TML 링커(15)의 화학 선택적 반응을 수행한 다음, 웨스턴 블롯 분석법(West
ern blot analysis)을 이용하여 분석한 단백질 구조체에 바이오틴을 제공하도록 바이오틴 히드라지드와 유도화하는
반응을 수행한 경우에 있어서의 겔 이동 분석을 도시한 도 14 및 도 15에 나타나 있다.
바이오틴 표지화된 단백질 구조체를 제공하기 위해 TML 결합된 단백질과 바이오틴 -히드라지드의 반응에 있어서의
분광학적 특성
(실시예 7 및 실시예 8 참조)
전술한 바와 같이, 단백질과 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커(단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 = H, X= 산소임)와의 반응을 통해
, 중성보다 높은 pH 수치에서 분석하는 경우(페녹사이드 이온이 존재하는 경우), 300 ㎚보다 큰 파장(예: 376 ㎚)에
서 최대 흡광도를 나타내는 링커-단백질 종을 제공할 수 있다(도 12 참조). 흡광 스펙트럼을 산성 pH 수치(예: pH 3.
5)에서 분석하는 경우, 300 ㎚보다 큰 흡광도가 거의 관찰되지 않았을 때, 이러한 종의 흡광 특성은 크게 변화한다(도
16 참조, ----- BSA 단독). 일반식 (XIVa)로 표시되는 단백질-링커 종(예: 단백질-TML)과 일반식 (XVIa), 일반식
(XVIb) 또는 일반식 (XVIc)로 표시되는 히드라지드(예: 바이오틴-히드라지드)와의 반응을 통해, 일반식 (XVa)로 표
시되며 활성 모이어티가 결합된 단백질 구조체(예: BSA-TML-바이오틴 또는 아프로티닌-TML-바이오틴)를 제공할
수 있다. 일반식 (XVa)로 표시되는 구조체를 pH 3.5에서 분석한 경우, 상기 구조체는 일반식 (XIVa)로 표시되는 단백
질-링커와 일반식 (XVIa), 일반식 (XVIb) 또는 일반식 (XVIc)로 표시되는 히드라지드 간의 반응 정도에 비례하는 고
염색 이동을 나타낸다. 이처럼, 불포화 히드라존 결합과의 접합 시에 방향족 발색단의 확장으로 인해 나타나는 이러한
스펙트럼 특성 때문에, 단백질-링커 종과 히드라지드의 반응 속도 및 반응 정도를 모니터링할 수 있으며, 상기 반응
속도 및 반응 정도를 그 흡수 스펙트럼으로부터 직접 정량화할 수 있다(도 16 및 도 17 참조). 이러한 흡광도의 측정
은 로딩에 대한 정량적 분석으로서, 그 예로서, 도 17에 도시한 324 ㎚, pH 3.5에서 측정된, 일반식 (XV)로 표시되는
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BSA-TML-바이오틴 및 아프로티닌-TML-바이오틴 구조체의 형성에 대한 전체 흡광도를 들 수 있다. 일반식 (Ⅰ)로
표시되는 링커와의 반응에 적용 가능한 표면 리신 잔기의 전체 농도는 BSA에서의 아프로티닌 농도의 약 4배이다. 이
같은 비율은 BSA의 최대 흡광도(0.90)와 아프로티닌의 최대 흡광도(0.25)에 분명히 반영되어 있다. 또한, 상기 반응
을 수행한 다음에는 ELISA 분석(도 18) 및 웨스턴 블롯 분석(도 19)를 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 구조체 형성 정도에 대한 실시간 정량 분석과 함께 구조체 형성에 있어서의 화학 선택적인 특성 둘
다 제어가 가능하기 때문에, 리간드 결합된 단백질의 생성에 이용되는 현재의 방법에 비해 확실히 크게 개선된 것이라
할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 면은, 일반식 (XIV)로 표시되는 링커-단백질(단, 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O
임)과 활성 모이어티 히드라지드와의 반응 정도 및/또는 반응 속도를 정량화하기 위한 비파괴적인 방법으로서, 300
㎚보다 큰 파장 및 7보다 낮은 pH에서 흡광 스펙트럼의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
전술한 방법을 상기 반응 속도의 측정 시에 이용하는 경우, 시간에 따른 흡광 스펙트럼 강도 또는 형광 강도의 변화를
계산하여 생성물 형성률을 결정할 수 있도록 하는 복수 개의 측정 단계가 포함될 수 있다.
전술한 방법은 통상적으로 실온(약 18 내지 25℃), 및 약 2 내지 6의 pH, 더 일반적으로는 3 내지 5의 pH, 바람직하
게는 3 내지 4의 pH 조건 하에서 수행된다.
상기 흡광 스펙트럼은 300 내지 400 ㎚ 범위의 파장에서 측정될 수 있다.
전술한 방법을 이용하면, 보정 그래프 또는 테이블을 작성할 수 있고, 상이한 캐리어에 대해서 가능한 최대 흡광 강도
를 계산할 수 있다. 캐리어에 대한 최대 흡광 강도는 그 캐리어 상에 적용 가능한 Q 잔기의 개수에 따른다.
300 ㎚보다 큰 파장(예를 들면, 단백질-TML-바이오틴 구조체의 경우에는 324 ㎚)에서의 흡광 시그널 상기 리간드
유도화된 링커-단백질 구조체의 형성을 실시간으로 모니터링할 수 있기 때문에, 세트 반응 시간 동안 단일의 활성 모
이어티 히드라지드를 연속적으로 첨가함으로써, 복수 개의 상이한 활성 모이어티 히드라지드의 첨가 반응을 제어할
수 있다. 이를테면, 324 ㎚, pH 3.5에서 측정한 흡광도가 최대 수치의 50%에 도달할 때까지 일반식 (XIV)로 표시되
는 화합물(예: BSA-TML)에 리간드 히드라지드 1을 첨가한 다음, 반응 배지를 리간드 히드라지드 2로 교환할 수 있
다. 324 ㎚, pH 3.5에서 측정한 흡광도가 최대 수치의 100%에 도달할 때까지 반응을 지속시켜, 일반식 (XV)로 표시
되며 리간드 히드라지드 1 및 리간드 히드라지드 2 각각의 로딩량이 50%인 리간드-단백질 구조체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 개선된 면역 반응 및 항원 반응성을 갖는 구조체를 얻기 위해서, B-세포 및 T-세포 항원을 둘 다 이용하면
단독의 캐리어 단백질을 유도화할 수 있다.
이러한 방식으로, 활성 모이어티와 함께 로딩된 선택된 비율의 그의 적용 가능한 잔기를 갖거나, 또는 다른 구현예로
서, 2개 이상의 상이한 활성 모이어티와 함께 로딩된 선택된 비율의 그의 적용 가능한 잔기를 가지며, 일반식 (XV)로
표시되는 화합물을 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 면은, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서,
일반식 (XV)에서,
R 2 는 H이고, X는 O이고;
상기 캐리어는 복수 개의 잔기 Q를 가지고;
상기 잔기 Q의 제1 선택%는 제1 활성 모이어티를 이용하여 유도화되며, 선택적으로
상기 잔기 Q의 제2 선택%는 제2 활성 모이어티를 이용하여 유도화되고,
상기 제조 방법은
a. 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 상기 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)과 일반식 (XVI)로 표시되는
제1 화합물을 7보다 낮은 pH에서 반응시키는 단계;
b. 300 ㎚보다 큰 파장에서 흡광 스펙트럼 강도를 측정함으로써 반응 과정을 모니터링하고, 상기 흡광 스펙트럼 강도
가 공지된 최대 강도의 제1 선택%에 도달할 때, 상기 반응을 중지시키는 단계; 및 선택적으로
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c. (a) 단계 및 (b) 단계의 생성물을 전술한 일반식 (XVI)로 표시되는 추가의 1종 이상의 화합물과 반응시키고, 300
㎚보다 큰 파장에서 그 흡광 스펙트럼 강도를 측정함으로써 상기 반응 정도를 모니터링하고, 상기 흡광 스펙트럼 강
도가 공지된 최대 강도의 제2 선택%에 도달할 때, 상기 반응을 중지시키는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
링커-단백질과 히드라지드의 반응 정도 또는 반응 속도를 정량화하기 위한 방법으로서, 본 발명은 통상 실온(약 18
내지 25℃), 및 약 2 내지 6의 pH, 더 일반적으로는 3 내지 5의 pH, 바람직하게는 3 내지 4의 pH 조건 하에서 수행된
다.
상기 흡광 스펙트럼은 300 내지 400 ㎚ 범위의 파장에서 측정될 수 있다.
선택적 비율의 상이한 활성 모이어티와 함께 로딩된 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 얻기 위한 다른 방법은 활성
모이어티-히드라지드의 등속 혼합물(isokinetic mixture)(즉, 상이한 히드라지드에 대한 상이한 반응 속도를 보정하
기 위해 몰 부분에 치중한 혼합물)을 이용한다. 가령, 전술한 바와 같은 방법을 이용 하여, 상이한 활성 모이어티와 일
반식 (XIV)로 표시되는 화합물의 반응 속도 및 상기 캐리어의 최대 로딩 속도를 계산하면, 상기 등속 혼합물의 보정
비율을 계산할 수 있다.
본 발명에 따른, 실험적으로 예시된 활성 모이어티 및 단백질을 간단히 대체함으로써, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커)(
단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 = H, X= 산소)를 이용하여 임의의 활성 모이어티 히드라지드와 임의의 단백질의 반응을 모
니터링하는 데 동일한 기본 원리를 이용할 수 있음을 알 수 있다.
단백질- 링커 -활성 모이어티 구조체의 분리 반응 시의 특성
(실시예 9 참조)
도 8은 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물 및 분리된 활성 모이어티 히드라지드(도시한 실시예에서는 옥시토신 에피토
프(13)를 분리)를 제공하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 일반식 (XV)로 표시되는 화합물의 정성적 및 정량적 분
리 반응을 도시한 것이다. 또한, 이러한 분리 반응 및 로딩된 활성 모이어티의 분석적 평가 방법은 로딩 반응을 모니터
링하는데 이용되는 전술한 흡광 특성을 역으로 이용함으로써 모니터링될 수 있다. 따라서, 일반식 (XV)로 표시되는
화합물로부터의 활성 모이어티 히드라지드의 분리 반응에 대한 실시간 모니터링은, 산, 예를 들면, 1N의 HCl(도 20,
도 21 및 도 22 참조)를 이용하여 단백질-링커-활성 모이어티 구조체를 처리 시에, 300 ㎚보다 큰 파장(예: 실시예 9
및 도 20에서 324 ㎚)에서 흡광 스펙트럼 피크의 감소도를 측정함으로써 달성될 수 있다. 도 20은 (도 16에 도 시한
효과와는 반대로) 분리 시간의 경과에 따른 324 ㎚에서의 흡광도 감소를 도시한 것이며, 도 22는 분리된 구조체의 바
이오틴에 대한 웨스턴 블롯 염색 강도에서의 감소를 도시한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)에서, R 2 는 H이고, X는 O임)로부터 활성
모이어티 히드라지드의 방출 정도 및/또는 방출 속도를 정량화하는 방법으로서, 300 ㎚보다 큰 파장, 및 7보다 낮은
pH에서 최대 흡광 스펙트럼의 최대치를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
전술한 방법을 상기 구조체로부터 상기 활성 모이어티 히드라지드의 방출 속도를 계산하는데 이용하는 경우, 시간에
따른 흡광 스펙트럼 강도의 감소도를 계산하기 위해 복수 개의 측정 단계를 수행해야 할 수 있다.
또한, 상기 방법은 통상적으로 실온(약 18 내지 25℃), 및 3보다 낮은 pH, 더 일반적으로는 2보다 낮은 pH에서 수행
된다.
상기 흡광 스펙트럼의 파장은 통상적으로 300 내지 400 ㎚에서 측정된다.
용액상의 생화학적/생물 물리학적/ 생의학적 용도
실시예 7, 실시예 8 및 실시예 9는 에피토프, 미모토프, 또는 소형 분자 약물, 신규 화합물(NEC: new chemical entit
y) 또는 진단용 마커과 같은 리간드가 될 수 있는 임의의 히드라지드 작용화된 활성 모이어티가 제어된 방법을 통해
화학 선택적으로 단백질의 전체 호스트에 결합할 수 있고, 아울러, 정량적이고도 제어된 방법을 통해 분리될 수 있다
는 것에 대해 기술한 것이다. 이러한 방법은 선별 (screening) 및 진단 용도 분야로까지 확장하여 응용할 수 있다.
예를 들면, 캐리어에 대한 리간드 화학 결합에서 분자간의 상호 작용이 모니터링될 수 있다. 이 경우, 리간드의 정의는
발색단(생화학적, 생물 물리학적 또는 화학적), 형광단(fluorophore)(생화학적, 생물 물리학적 또는 화학적), 루미노
포어(생화학적, 생물 물리학적 또는 화학적), 인광, 방사화학물, 양자점(quantum dot), 전자 스핀 태그, 자성 입자, 핵
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자기 공명 태그, X선 태그, 마이크로파 태그, 전자 화학, 전자 물리학(예: 증가된 저항), 표면 플라즈몬 공명(surface p
lasmon resonance), 열량계 등과 같은 표지화 모이어티를 포함하는 것으로 확대될 수 있다. 본 발명의 캐리어를 이용
하는 경우, 상호 보완적인 물리학적, 화학적 또는 생물학적 기법을 이용하여 분자간 상호 작용이 모니터링될 수 있는
가용성 중간체를 생성함으로써, 리간드에 의해 표지화하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 면은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)에서, E 또는 G가 표지화 모이어티
임)을 제공한다.
이러한 표지화 모이어티를 구체적으로 예시하면 바이오틴, 및 Texas Red (R)와 같은 발색단을 들 수 있다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 원리에 따른 진단용 용도의 실시예를 도시한 것이다. 여기서, 일반식 (XV)로 표시되는 B
SA-TML-바이오틴 및 아프로티닌-TML-바이오틴 구조체의 형성에 있어서의 특징은 바이오틴 분석을 위한 ELISA(
도 18) 및 웨스턴 블롯법(도 19)에 의해 평가할 수 있다. ELISA 분석에 있어서는, 상기 단백질 -TML-바이오틴 샘플
(시간 경과에 따라 상기 구조체의 형성에 대해 모니터링하는 실험)이 Immulon 2HB 마이크로티터 플레이트 상에서
흡수되고, 바이오틴에 대해 표지화된 항체를 이용하여 검사한다. 도 18은 시간 경과에 따른 구조체의 형성을 도시한
것으로서, 흡광 측정 및 도 16 및 도 17에 도시된 데이터에 따라 모니터링된 반응과 동일함을 나타내는 데이터를 보
충한 것이다. 바이오틴 분석을 위한 웨스턴 블롯법(도 19)에 있어서는(시간 경과에 따라 상기 구조체의 형성에 대해
모니터링하는 실험) 시간 경과에 따른 상기 구조체의 형성을 나타내며, 흡광 측정 및 도 16, 도 17 및 도 18에 도시한
ELISA 분석법에 따라 모니터링된 반응과 동일함을 나타내는 데이터를 보충한 것이다.
통상적으로 실제의 진단 용도는 이하에 기술될 원리에 근거한 것일 수 있다. 전술한 바와 같은 정성적 및 정량적 방법
을 이용하면, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커를 이용하여 1종 이상의 공지된 병원성 항원(들)을 캐리어 단백질과 화학
선택적으로 결합시킬 수 있다. 그런 다음, 상기 단백질-링커-항원(들) 구조체가 표면(예: 진단용 스트립) 상에 흡수될
수 있고, 생물학적 샘플로서, 상기 항원(들)이 유래한 병원체(들)에 의해 유발된 질환을 갖고 있다고 생각되는 환자와
그 표면을 접촉시켰다. 상기 환자가 병원성 질환을 갖는 경우에는 항체 반응이 상기 표면에서 상기 단백질-링커-항원
(들) 구조체에 결합할 수 있다. 그런 다음, 상기 환자가 병원성 질환을 갖고 있음이 확인되는 경우에는, 정성적 반응을
생성하기 위해, 통상의 표지화된 항-항체를 이용하여 상기 표면을 검사할 수 있다.
용액상 용도
고상(즉, 비용액상)의 화학 결합을 예시하면, 본 발명의 조성물을 이용하여, 리간드(그 예로서, 펩타이드, 단백질, 당,
리피드, 핵산, 알칼로이드, 비타민 등이 포함되나, 이에 제한되지 않음)에 대해 결합한 (탄화수소 기재의 플라스틱, 폴
리머, 유리, 겔, 수지 등과 같은)합성 물질, 단백질, 당(예: 면), 지질(리포솜) 등과 같은 천연 폴리머를 들 수 있으나,
이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 일면은 상기 캐리어가 수용액에 불용성인 고체 표면인 경우에 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을
제공한다.
본 발명의 고상 용도로서 이하의 것이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
고상의 생화학적/생물 물리학적/ 생의학적 용도
(실시예 10 참조)
선택된 시약, 또는 시약들을 표면(즉, 고상)에 고정화할 수 있는 기법을 이용함으로써, 다양한 범위의 용질에 고정화
되고 배양 후에 세척 공정에 의해 제거될 수 있는 시약을 노출시킬 수 있다. 따라서, 용질이 상호 교환 가능한 것인 반
면, 이 같은 고정화 반응을 통해서 상기 시약을 유지시킬 수 있다. 그러므로, 본 기법은 시약의 손실 없이 단독의 시약
으로 실행될 수 있는 복수 개의 단계를 수행할 수 있으며, 원치 않는 용질을 제거함으로써 보다 특이한 검출법이 필요
하다. 이러한 방법론을 이용하는 기법으로서는, 분자간의 상호 작용이 모니터링될 수 있도록 한 고상에 대한 리간드
및/또는 캐리어의 화학 결합을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 경우, 본 발명은 효소면역측정법(ELISA: enzy
me-linked immunosorbent assay), 표면 플라즈몬 공명, QCM(quartz crystal microbalance), 원자간력 현미경 (A
FM: atomic force microscope) 등에 적용될 수 있다. 고체 표면에 대한 선택적 공유 결합 역시 마이크로어레이(micr
oarray)(펩타이드, 단백질 및 핵산을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 생성할 수 있다(예를 들면, 유리 플레이트에 대
한 바이오틴 히드라지드의 부착 및 분리에 관한 도 23을 참조).
전술한 바와 같은 정성적 및 정량적 용도 외에도, 이와 같이 제어된 분리 반응은 포착 및 분리 메카니즘이 유용한 기
타 용도에 이용될 수 있다. 예를 들면, 단백질-링커-리간드와 같이, 일반식 (XV)로 표시되는 화합물은 96-웰 플레이
트 상에 고정화될 수 있다(예를 들면, 96-웰 플레이트에 대한 바이오틴 히드라지드의 부착 및 ELISA 분석에 관한 도
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24를 참조).
분리/정제
(실시예 11 참조)
정제 공정은 생명 과학에 이용되는 기본적인 기법이다(Scopes, R.K., (1993),Protein Purification: Principles and
Practice, 3 rdEd., Springer-Verlag New York, Incorporated; Williams, B.L. and Wilson, K., (1983),A Biolog
ist's guide to Principles and techniques of Practical Biochemistry, 2 ndEd., Edward arnold (Publishers) Ltd.,
London). 연구용으로 정제된 물질을 생성하기 위해, 혼합물로부터 분리한 넓은 범위의 분자를 정제하는데 서로 다른
각종 방법들이 이용된다. 이러한 정제 방법을 예로서, 고상(즉, 수지)과 액상 사이의 분자들을 분획 시에 분자를 생리
화학적 물성을 기초로 하여 분리하는 크로마토그 래피가 있다. 크로마토그래피는 그것에 이용되는 수지상 및 용액상
을 기준으로 다양하게 분류될 수 있다. 그 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과 크로
마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 친화 크로마토그래피 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
(Scopes, R.K., (1993),Protein Purification: Principles and Practice, 3 rdEd., Springer-Verlag New York, In
corporated; Williams, B.L. and Wilson, K., (1983),A Biologist's guide to Principles and techniques of Practic
al Biochemistry, 2 ndEd., Edward Arnold (Publishers) Ltd., London).
혼합물로부터 단백질을 정제하는 공정(즉, 단백질의 포착 공정)에서 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커의 용도에 대한 예는
도 24에 도시한 바와 같다. TML 링커(14)를 이용하여 세파로즈 비드(sepharose bead)를 유도화하고, 이어서, 바이
오틴 히드라지드와 반응할 일반식 (XIVa)로 표시되는 화합물을 형성하여, 상기 '캐리어'가 세파로즈 비드인 일반식 (X
Va)로 표시되는 화합물을 형성한다. 그런 다음, 이 바이오틴 유도화된 비드를 이용하여 상기 단백질 ExtrAvidin-HR
P를 용액으로부터 당긴다(포착한다). ExtrAvidin-HRP의 존재 하에 컬러를 띄는 기질을 추가하여, 상기 세파로즈 비
드의 컬러 염색법에 의해 ExtrAvidin-HRP의 존재를 결정한다(도 24).
고상에 대한 리간드의 화학 결합을 통해 생리 화학적 물성을 기초로 하여 선택적으로 분리시킬 수 있다. 이러한 용도
를 예시하면, 친화 정제법(affinity purification), 키랄 분리법(chiral separation) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지
않는다.
일반식 (XV)로 표시되는 화합물이 분석 또는 분리/정제법에 이용되는 경우에는, E 및 G가 종종 분리될 분석 대상물
에 특이성을 갖는 리간드로부터 유도될 수 있다. 또한, 표지화 분자로서, 활성 모이어티 E 또는 G를 상기 캐리어에 추
가적으로 결합시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 혼합물로부터 화합물의 분리 방법으로서, 상기 혼합물을 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 전술
한 바와 같이, 화학식 (XV)에서 E 또는 G가 분리될 화합물에 특이적으로 결합하는 리간드이고, 상기 캐리어가 고체
지지체임)과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 분석 대상물을 포함하는 것으로 추정되는 혼합물을 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 전술한 바와
같이, 화학식 (XV)에서 E 또는 G는 상기 분석 대상물과 특이적으로 결합하는 리간드이고, 상기 캐리어는 고체 지지체
임)과 접촉시키는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.
의학용 장치
조직/고체 표면의 계면에 생물학적으로 활성이 있는 또는 불활성 분자를 제공할 수 있는 의학용 장치 및 소모품의 화
학적 유도화 방법. 예를 들면, 펩타이드 성장 인자, 화학유인성 단백질 또는 이들 둘의 유사체를, 현대의 커버링에 통
상적으로 이용되는 기능화된 폴리머에 대해 제어된 접합법은 차세대의 생체 활성이 있는 상처 드레싱을 개선할 수 있
다. 다른 예를 들면, 헤파린을 폴리머의 표면에 결 합시킴으로써, 투석 튜빙 반응을 유도화할 수 있기 때문에, 혈액 응
고 반응의 위험을 저하시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 캐리어가 통상적으로 상처 드레싱에 이용되는 유형의 기능화
된 폴리머이고, E 또는 G가 펩타이드 성장 인자, 화학유인성 단백질, 리간드 또는 이들 중 1종의 유사체임)을 포함하
는 상처 드레싱을 제공한다.
또한, 본 발명은 상처에 전술한 바와 같은 상처 드레싱을 적용하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법을 제공한다. 또한,
본 발명은 (1) 화학식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 상기 화학식 (XV)에서, 상기 캐리어가 상처 드레싱에 통상적으로
이용되는 타입의 기능화된 폴리머이고, E 또는 G가 펩타이드 성장 인자, 화학유인성 단백질, 리간드 또는 이들 중 1종
의 유사체임)의 상처 치료용 용도; 및 (2) 전술한 상처 치료용 드레싱의 제조에 이용되는 상기 화합물의 용도를 제공
한다.
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본 발명의 또 다른 면은 화학식 (XV)로 표시되는 불용성 화합물(상기 화학식 (XV)에서, 상기 캐리어가 투석 튜빙에
이용하는데 적합한 폴리머이고, E 또는 G가 헤파린임)을 포함하는 투석용 튜빙을 제공한다.
아울러, 본 발명은 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(상기 화학식 (XV)에서, 상기 캐리어가 투석 튜빙(dialysis tubing)
에 이용하는데 적합한 폴리머이고, E 또는 G가 상기 투석 튜빙에 이용하기 위한 헤파린임)이 투석 튜빙 제조용인 것
을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 발명의 상세한 설명 및 도면, 그리고 실시예를 참조하여 더욱 상 세하게 설명될 수 있으나, 이들에 제한되지
않는다.
도면의 간단한 설명
도 1은 아민 특이성 형광 시약 FLURAM 1 ™ 에 대한 BSA의 양론적 역가를 도시한 것으로서, 하나의 반응 상수를
유지하고, 그 나머지는 점진적으로 증가시킴으로써, 등가 지점을 나타내는 평탄면에 도달하였으며, BSA 내에 유리
아민의 개수가 공지되어 있기 때문에, 상기 반응에 참여한 유리 아민의 개수를 알아낼 수 있다(21-25).
도 2는 3종의 BSA 구조체인 TML 85, Tfa85 및 BAL85의 분자량과 비교하여, BSA의 분자량을 도시한 소듐 도데실
설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동 겔임.
도 3은 로그 농도에 대한 파장 650 ㎚에서의 흡광도 단위(AU)의 플롯으로서, pH 8에서 10 nM의 암모늄 바이카보네
이트 내 링커 BSA 구조체(20-22)의 용해도를 도시한 것임.
도 4는 로그 농도에 대한 파장 650 ㎚에서의 흡광도 단위(AU)의 플롯으로서, pH 4.5에서 0.1 M의 소듐 포르메이트
내 링커 BSA 구조체(20-22)의 용해도를 도시한 것임.
도 5는 로그 농도에 대한 파장 650 ㎚에서의 흡광도 단위(AU)의 플롯으로서, pH 6에서 10 mM의 포타슘 포스페이트
내 링커 BSA 구조체(20-22)의 용해도를 도시한 것임.
도 6은 로그 농도에 대한 파장 650 ㎚에서의 흡광도 단위(AU)의 플롯으로서, pH 7에서 10 mM의 포타슘 포스페이트
내 링커-BSA 구조체(24 및 27)의 용해도를 도시한 것임.
도 7은 BSA.BAL, BAL55-Conj, BSA.TML 및 TML-con.의 분자량과 비교하여, BSA의 분자량을 도시한 소듐 도데
실 설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동 겔임.
도 8은 1N의 염산을 이용하여 가부분해 한 후의 BSA-TML85-에피토프 접합체(24)의 HPLC 분석 결과, 및 가수분
해를 통해 BSA-TML85 및 에피토프(13)이 재생성된 것을 도시한 도면.
도 9 내지 도 11은 각각 BSA 단독으로 면역시킨 마우스로부터 얻은 혈청의 ELISA 분석 결과(도 9), BAL 링커를 이
용하여 BSA에 접합시킨 옥시토신을 이용하여 면역시킨 마우스로부터 얻은 혈청의 ELISA 분석 결과(도 10), 및 TML
링커를 이용하여 BSA에 접합시킨 옥시토신을 이용하여 면역시킨 마우스로부터 얻은 혈청의 ELISA 분석 결과(도 11
)를 도시하였으며, BSA 단독에 대해 증가된 항체를 통해 두 구조체가 인식되었으며, BSA가 상기 두 구조체 내에 존
재하는 캐리어 단백질이기 때문에 양성 대조군으로서 제공됨:
도 9는 BSA 단독으로 면역시킨 마우스에서 BSA-BAL55-옥시토신 및 BSA-TML-옥시토신 구조체가 증가한 것이
인식된 항체의 역가를 도시한 도면;
도 10은 BSA-BAL55-옥시토신 구조체를 이용하여 면역시킨 마우스에서 BSA(비특이성) 및 BSA-BAL55-옥시토신
구조체(특이성)의 역가가 증가한 것을 도시한 도면;
도 11은 BSA-TML85-옥시토신 구조체를 이용하여 면역시킨 마우스에서 BSA(비 특이성) 및 BSA-TML85-옥시토
신 구조체(특이성)의 역가가 증가한 것을 도시한 도면.
도 12는 pH를 증가시킴에 따른 고염색 이동을 나타내는, 다양한 pH 수치에서의 BSA-TML 흡광 스펙트럼을 도시한
것이며, 그 안에 삽입된 도면은 pH에 대한 파장 376 ㎚에서의 흡광도의 플롯임.
도 13은 투석 후의 버퍼(100 mM의 소듐 포르메이트; pH 3.5)의 희석 샘플에 대한 형광 스펙트럼; pH 12에서의 아프
로티닌-TML 및 BSA-TML.
공개특허 10-2005-0007454
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도 14는 단백질 및 TML-NHS(15) 처리된 단백질 샘플의 은색 염색된 SDS-NuPAGE 겔을 도시한 도면.
도 15는 바이오틴화된 단백질 샘플의 TMB 노출된 ExtrAvidinHRP 처리 PVDF 블롯.
도 16은 pH 3.5에서 바이오틴-히드라지드를 첨가 시에, BSA-TML 흡광 스펙트럼상의 고염색 변화를 도시한 도면.
도 17은 pH 3.5에서 바이오틴-히드라지드를 첨가 시에, BSA-TML(□) 또는 아프로티닌-TML(■)에 대한 324 ㎚
파장에서의 흡광도 변화 속도를 도시한 도면.
도 18은 바이오틴-히드라지드를 첨가 시에, 아프로티닌-TML 또는 BSA-TML(도 16 및 도 17에서와 동일한 샘플)
의 동력학적 반응으로부터 얻은 샘플의 ELISA 결과를 도시한 도면.
도 19는 바이오틴-히드라지드를 첨가 시에, 아프로티닌-TML 또는 BSA-TML의 동력학적 반응으로부터 얻고 켄칭
된 샘플(도 16, 도 17, 도 18 및 도 22에서와 동 일한 샘플)의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면으로서, 상기 등가
의 아프로티닌 샘플 및 BSA 샘플을 사전 혼합한 다음, 로딩함.
도 20은 1M의 HCl로 산성화하는 경우, BSA-TML-바이오틴에서의 스펙트럼 변화를 도시한 도면으로서, 점이 찍힌
선은 희석하지 않은 샘플에 대한 스펙트럼으로부터 생성된 미처리된 BSA-TML-바이오틴의 표준화 스펙트럼을 나
타냄.
도 21은 1M의 HCl로 산성화하는 경우, 아프로티닌-TML-바이오틴 또는 BSA-TML-바이오틴의 동력학적 반응으
로부터 얻은 샘플의 Nu-PAGE 겔을 도시한 도면으로서, 등가의 아프로티닌 샘플 및 BSA 샘플을 사전 혼합한 다음,
로딩함.
도 22는 1M의 HCl로 산성화하는 경우, 아프로티닌-TML-바이오틴 또는 BSA-TML-바이오틴의 동력학적 반응으
로부터 얻은 샘플의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면으로서, 등가의 아프로티닌 샘플 및 BSA 샘플을 사전 혼합
한 다음, 로딩함.
도 23은 아미노프로필 실란, TML 링커 및 바이오틴-히드라지드로 처리하고, TMB 전개된 ExtrAvidinHRP 처리된
유리 슬라이드로서, A는 현상한 슬라이드의 이미지이고, B는 상기 슬라이드 단면의 3차원 표면 강도 플롯(대략 점선
으로 표시한 박스 부분).
도 24는 TML-1,4-디아미노부탄 또는 1,4-디아미노부탄 단독으로 유도화하고, 바이오틴 히드라지드 처리된 웰을
도시한 Reacti-Bind 마이크로티터 플레이트의 열(row).
도 25는 ExtrAvidin-HRP에 노출되고 TMB 시약을 이용하여 현상된, TML-NHS 및 바이오틴-히드라지드 처리된 E
AH 세파로즈 비드의 QX3 현미경 캡쳐 이미지이며, 대조군 비드(즉, TML-NHS 또는 바이오틴-히드라지드로 처리하
지 않은 것은 무색임).
실시예
하기 실험(실시예 1 내지 실시예 5)은 에피토프의 소 혈청 알부민(BSA) 캐리어 단백질에 대한 제어된 접합법에 있어
서,전하 균형을 이룬 링커의 이용을 예시한 것이다. 일련의 체내 용해도 및 체내 면역화 실험을 통해, 면역원에 대한
항체 반응 형성을 위한 전하 균형을 이룬 링커 구조체의 우수한 특성을 확인할 수 있다. 이 실험은 하기와 같다:
1. 실시예에 따른 에피토프 및 링커 구조체의 합성,
2. BSA 링커 구조체를 이용한 용해도 연구,
3. BSA-링커-에피토프 구조체를 이용한 용해도 연구,
4. BSA-링커-에피토프 구조체의 화학적 분석,
5. BSA-링커-에피토프 구조체를 이용한 면역화 반응 연구.
실험 방법
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실험에 이용된 모든 시약을 상업적으로 입수 가능한 고품질의 것이었고, 수여한 것으로서 이용되었다. 별도의 언급이
없는 경우, 모든 화학 물질 및 생화학 물질은 Sigma Chemical Company (UK, Dorset, Poole 소재)로부터 구입한 것
이다. 모든 고상 합성법은 'Fmoc/tBu' 과정을 이용하여 수행하였다(참조: Atherton, E and Sheppard, R. C. in 'Solid
Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach', IRL Press, 1989). Bachem UK Ltd.(UK, St. Helens 소재)로부
터 입수한 Fmoc N-ε -트리메틸리신을 제외하고, Fluram(플루오레스카민(fluorescamine))과 함께 표준 Fmoc 아
미노산은 Chem-Impex International(USA, IL, Wood Dale 소재) 및 Novabiochem(UK, Nottngham 소재)로부터
입수하였다. PS-카르보디이미드 수지로는 Romil Technologies (스위스, Muttenz 소재)로부터 입수하였다. 실험에
사용된 모든 용매는 Romil(UK, Cambridge 소재)로부터 구입한 것이다. 진공 하에 여과시키기 위해 폴리프로필렌 프
릿(frit)이 장착된 폴리프로필렌 주사기 내에서 수동으로 고상 합성 반응을 수행하였다. G1322A 탈기 모듈 및 G1365
B 다중 파장 UV-VIS 검출기를 갖고, G1311A 4개의 펌프 시스템을 포함하는 Agilent 1100 씨리즈의 장치 상에서 H
PLC(high pressure liquid chromatography) 분석을 수행하였다. 데이터를 수집하여 Chemstation 2D 소프트웨어를
이용하여 적분하였다. Zorbax, 5 ㎛, C8 역상 칼럼(150×4.6 ㎜ 내경)에서 1.5 ㎖/분의 유속으로, 215 ㎚ 및 254 ㎚
에서 모니터링하면서 분석하였다. 이 때 사용된 용출제는 (A) 물 내의 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 90%의 아
세토니트릴/10%의 용출제 A로서, 10% B에서 구배 개시하는데 이용되었으며, 7분 동안 90% B로 증가시키고, 1분
간 유지시킨 다음, 1분간 10%의 B로 회복시키고, 이어서 4분간 초기 상태를 유지시켜 칼럼을 보정하였다. 그런 다음,
전술한 바와 같은 장치 및 용출제, 그리고 Phenomenex Jupiter C4 역상 칼럼(250×10 ㎜ 내경)을 이용하여, 4 ㎖/분
의 유속으로 세미-프리패러티브 HPLC를 수행하여 화합물을 정제하였다. Agilent 1100 씨리즈 LC/MSD 전자스프레
이 질량 분광계에서 정제된 화합물의 분자량을 결정하였다. Centricon 원심 분리 여과기(50,000 MWCO)(USA, MA,
Millipore 소재)를 이용하여 BSA 접합체를 농축한 다음, Slide-A-Lyser 투석 카세트(10,000 MWCO)(USA, IL, Pie
rce 소재)를 이용하여 투석함으로써 정제시켰다. 제조자의 설명서에 따라, 3-(N-모르폴리노)프로판 설폰산(MOPS)
버퍼 시스템(Invitrogen)을 이용하여, 4∼20%의 NuPAGE 겔(U.K., Paisley, Invitrogen)을 이용한 소듐 도데실 설페
이트(SDS-PAGE) 내에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 수행하여, 상기 BSA 접합체의 분자량 평가 및 순도를
결정하였다. 단백질을 가시화하기 위해, SilverExpress 염색 키트(Invitrogen)를 이용하였다. 모든 경우에 있어서, 겔
건조 키트(Invitrogen)를 이용하여 상기 겔들을 건조하고, 제공을 목적으로 그레이 스케일 의사 색채법(grey scale fa
lse colour)(OfficeJet Pro1175c; Hewlett Packard)을 이용하여, 상기 겔을 300 dpi의 해상도로 스캐닝하였다. 그런
다음, Gemini 플레이트 판독기(Molecular Devices, Crawley, UK)를 이용하여 Microfluor W1 96-웰 마이크로티터
플레이트(Dynex Thermo Lifesciences, UK) 내에서 Fluram 형광 분석을 수행하여, 390 ㎚(여기) 및 460 ㎚(방출)
파장에서 니터링하였다. Spectramax384 96-웰 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 이용하여 984-웰 PS 마이
크로플레이트 내, 650 ㎚ 파장에서 혼탁도를 측정하고, 96-웰 PS 마이크로플레이트 내, 595 ㎚의 파장에서 브래드포
드 분석(Bradford assay)을 수행하였다(Greiner Bio-One Ltd., Stonehouse, Gloucestershire, UK).
이미지를 캡쳐, 분석 및 처리. 디폴트 세팅 시에 HP Precision ScanPro 3.02 소프트웨어를 이용한 Hewlett Packard
C7710A 스캐너를 이용하여, 이미지를 캡쳐하였다. 통상의 방법에 따라, 트루 컬러(32 bit)를 이용하여 최소 해상도 6
00 d.p.i.에서 이미지를 스캐닝하였다. Powerpoint(Microsoft Corp.)를 이용하여 소 제목과 함께 이미지를 표시하였
다. ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij)를 이용하여 이미지 분석 및 처리를 수행하였다.
실시예 1 - 에피토프 및 링커 구조체의 합성
양호한 수율 및 순도의 바람직한 화합물을 얻기 위해, 표준 용액 화학물 및 Fmoc 용액상 기법을 이용하여 옥시토신
유사체(13) 및 링커(14-19)의 합성 반응을 원활하게 진행하였다(참조: Atehrton, E and Sheppard, R. C. in 'Solid P
hase Peptide Synthesis: A practical Approach', IRL Press, 1989). 상기 링커를 유리 산(14, 16, 18)으로서 보관
하고, 활성화 숙신이미드 에스테르의 링커(15, 17, 19)를 필요 시에 신선하게 제조하였다.
공개특허 10-2005-0007454
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A. 옥시토신 유사체 (13)의 합성
TGR 수지(0.25 g, 0.05 m㏖, 치환: 0.2 m㏖/g) 상에서 Fmoc/tBu 보호법을 이용하여, (한 글자 코드) 서열 아세틸-C
YIQNCPLGK(COCH 2 CH 2 CONHNH 2 )-NH 2 를 갖는 옥시토신 유사체(13)를 수동 합성하였다. 상기 수지를 로
딩하는 대신에, 용매로서 디메틸포름아미드를 이용하고 3 당량의 아미노산 및 커플링 시약을 이용한 HBTU/HOBt법
에 의해, 상기 Fmoc 아미노산의 결합을 달성하였다. 그런 다음, 디메틸포름아미드 내에 20%의 피페리딘을 이용하여
15분간 처리함으로써, 상기 Fmoc기를 제거하였다. 그리고, Dde 측쇄 보호를 통해 C-말단 리신 잔기를 도입하여, 합
성 시의 후반 단계에서 직교 탈보호 시켰다. 최종 잔기를 Fmoc 탈보호한 다음, 디메틸포름아미드 내에 아세트산 무수
물(48 ㎕, 0.5 m㏖) 및 디이소프로필에틸아민(43 ㎕, 0.25 m㏖)을 이용하여 2시간 동안 N-말단을 아세틸화하고, 디
메틸포름아미드 내에 2%의 히드라진을 이용하여 15분간 상기 리신 측쇄의 Dde 탈보호기를 제거하였다. 그런 다음,
디메틸포름아미드 내에 숙신산 무수물(50 ㎎, 0.5 m㏖)과 디이소프로필에틸아민(43 ㎕, 0.25 m㏖)과 2시간 동안 반
응시킨 다음, 히드라진과 반응시켜, 상기 리신 측쇄의 유리 아민을 연장시키고, HBTU/HOBt(과량)을 이용하여 3시간
동안 디메틸포름아미드 내 10% 용액으로서 커플링시켰다. 최종적으로, 92.5%의 트리플루오로아세트산/ 2.5%의 트
리이소프로필실란/ 2.5%의 물/ 2.5%의 에탄디티올(40 ㎖/g 수지)을 이용하여 75분간 상기 수지로부터 펩티드를 분
리시켰다. 상기 수지를 여과 공정에 의해 제거하고, 그 여과물을 질소 분사하면서 농축시켰다. 이렇게 하여 얻어진 조
생성물을 석출하고, 차가운 메틸 tert-부틸에테르(3×50 ㎖)로 세척한 다음, 50%(수용액) 아세토니트릴에 재용해하
여, 동결 건조하였다. 상기 펩타이드를 암모늄 바이카보네이트(0.1 M, pH 8) 내에 100 μM의 농도로 재용해하고, 과
산화수소(1.5 당량)를 이용하여 45분간 산화시켰다. Ellman 시약을 이용하여 LC-ESI-MS에 의해 상기 반응을 모니
터링하고, 끝으로 10%(수용액) 아세트산(과량)을 이용하여 켄칭(quenching)하였다. 상기 혼합물을 1회 더 동결 건조
시킨 다음, 세미 프리패러티브 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 수율: 24 ㎎, 0.019 m㏖, 37%. ESI-MSm/z: 1291.3(
calc.for M H 1291.5). HPLC 유지 시간: 3.44분.
B. { 5S -(카르복시메틸카르바모일)-5-[5-(4-포르밀-3-하이드록시페녹시)펜타노일 아미노]페닐} 트리메틸암
모늄 (14)의 합성.
2-클로로트리틸 수지(0.19 g, 0.19 m㏖)에서 Fmoc/tBu 보호법을 이용하여, 상기 화합물을 수동 합성하고, 글리신(
치환: 1.0 m㏖/g)을 이용하여 사전 로딩하였다. 상기 수지를 로딩하는 대신에, 용매로서 디메틸포름아미드를 이용하
고 3 당량의 아미노산 및 커플링 시약을 이용한 HBTU/HOBt법을 이용하여, Fmoc-Lys(Me) 3 -OH를 이중 결합시
켰다. 그런 다음, 디메틸포름아미드 내에 20%의 피페리딘을 이용하여 15분간 처리함으로써 상기 Fmoc기를 제거하
였다. 그리고, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로 포스페이트(BOP)를 이용하
공개특허 10-2005-0007454
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고, 상기 수지를 로딩하는 대신에, 용매로서 디메틸프롬아미드 및 3 당량의 (16) 및 커플링 시약을 이용하는 (BOP/H
OBt)법에 의해, 5-(4-포르밀-3-하이드록시페녹시)펜탄산(BAL)(16)의 커플링을 달성하였다. 상기 BAL의 2-하이드
록시기 위치에 형성된 임의의 에스테르를 제거하기 위해, 최종 20%의 피페리딘 처리를 수행하였다. 최종적으로, 디
클로로메탄 내에 5%의 트리플루오로아세트산을 이용하여 각각 5분간 몇 회 처리함으로써, 상기 수지로부터 펩티드
를 분리시켰다. 그런 다음, 상기 수지를 여과 공정에 의해 제거하고, 수집한 여과물을 질소 분사하면서 농축시켰다. 이
렇게 하여 얻어진 조생성물을 석출하고, 차가운 메틸 tert-부틸에테르로 세척한 다음, 30%(수용액) 아세토니트릴에
재용해하여, 동결 건조하였다. 끝으로, 상기 화합물을 세미 프리패러티브 RP-HPLC에 의해 정제한 다음, 순수한 분획
물을 채집하여 1회 더 동결 건조시켜, 회색에 가까운 백색(off-white)의 고체를 얻었다. 수율: 35 ㎎, 0.075 m㏖, 39
%. ESI-MS m/z: 466.2(calc.for M H 466.26). HPLC 유지 시간: 3.75분.
C. { 5S -[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메틸)카르바모일]-5-[5-(4-포르밀 -3- 하이드록시페녹시
) 펜타노일아미노 ] 펜틸 } 트리메틸암모늄 (15).
화합물(14)(35 ㎎, 0.075 m㏖)을 디메틸포름아미드(2 ㎖)에 용해한 다음, 디클로로메탄(10 ㎖) 내에 PS-카르보디이
미드(288 ㎎, 0.375 m㏖)의 교반 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분간 교반한 다음, 디메틸포름아미드(1 ㎖) 내
에 용해한 N-하이드록시숙신이미드(9 ㎎, 0.075 m㏖)를 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응물을 실온에서 교반하고,
반응이 완료될 때까지(5시간) HPLC에 의해 모니터링하였다. 상기 수지를 여과 공정에 의해 제거하고, 용매를 진공
제거한 다음, 추가의 정제 공정을 수행하지 않고 상기 화합물을 이용하였다. 수율: 38 ㎎, 0.068 m㏖, 90%. ESI-MS
m/z: 563.3(calc. for M H 563.3). HPLC 유지 시간: 4.16분.
D. 5-(4- 포르밀 -3- 하이드록시페녹시 ) 펜탄산 (BAL)(16).
2,4-디하이드록시벤즈알데히드(10 g, 0.072 ㏖) 및 스프레이 건조된 포타슘 플루오라이드(8.4 g, 0.144 ㏖)를 60℃
의 무수 아세토니트릴(150 ㎖) 내에서 20분간 강하게 교반하였다. 메틸-5-브로모발레레이트(42.3 g, 0.216 ㏖)를 한
부분에 첨가하고, 상기 혼합물을 5시간 동안 적당히 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고, 상기 용매를 진
공 제거하였다. 그 잔류물을 물(100 ㎖)과 에틸 아세테이트(50 ㎖) 사이에 분획하였다. 그 수성층을 에틸아세테이트(
2×30 ㎖)로 2회 이상 세척하고, 결합 유기층을 물로 역세척(back-wash)한 다음, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시
키고, 여과하여 증발 건조시켰다. 이렇게 하여 얻어진 적색의 오일 을 에테르(30 ㎖) 및 헵탄(20 ㎖)로부터 재결정화
하였다. 그런 다음, 얻어진 메틸 에스테르를 테트라하이드로퓨란(120 ㎖)에 용해하여, 실온에서 강하게 교반하였다.
이 용액에, 물(60 ㎖)에 용해된 리튬 하이드록사이드(3.7 g, 0.088 ㏖)를 첨가하고, 상기 혼합물을 4시간 동안 교반하
였다. 상기 용매를 감압 제거하고, 그 결과물로 얻어진 오일 잔여물을 물(30 ㎖)로 희석시킨 뒤, 메틸-tert-부틸 에테
르(2×50 ㎖)를 이용하여 2회 세척하고, 농축 염산을 이용하여 pH 2로 산성화한 다음, 에틸 아세테이트(4×30 ㎖)를
이용하여 추출하였다. 그 결합된 에틸 아세테이트를 무수 황산마그네슘 상에서 건조한 다음, 여과시키고, 증발 건조시
켜 백색의 고체 생성물을 얻었다. 수율: 9.86 g, 0.041 ㏖, 57%.
E. 5-(4- 포르밀 -3- 하이드록시페녹시 ) 펜탄산 2,5- 디옥소피롤린 -1-일 에스테르(BAL- OSu )(17).
PS-카르보디이미드 수지(4.2 g, 5.5 m㏖)를 디클로로메탄(45 ㎖) 내에 현탁시키고, 5분간 교반시켜 상기 수지를 팽
윤시켰다. 화합물(16)(1.0 g, 4.2 m㏖)을 첨가하고, 디클로로메탄(10 ㎖) 내에 용해시킨 다음, 상기 수지 혼합물을 추
가로 20분 동안 교반하고, 디메틸포름아미드(4 ㎖) 내에 용해된 N-하이드록시숙신이미드(0.46 g, 4.0 m㏖)를 첨가
하였다. 그런 다음, 상기 반응물을 실온에서 교반하여 반응이 완료될 때까지(18시간) HPLC에 의해 모니터링하였다.
상기 수지를 여과 공 정에 의해 제거하고, 용매를 진공 제거한 다음, 이소프로판올로부터 그 최종 생성물을 재결정화
하였다. 수율: 1.3 g, 3.8 m㏖, 92%. ESI-MSm/z: 336.1(calc. for M H 336.1. HPLC 유지 시간: 6.18분.
F. [2S-[5-(4-포르밀-3-하이드록시페녹시)펜타노일아미노]-6-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노 )헥사노일아
미노]아세트산(Tfa)(18).
2-클로로트리틸 수지(0.3 g, 0.3 m㏖)에서 Fmoc/tBu 보호법을 이용하여, 고상 합성법에 따라 상기 화합물을 수동
합성하고, 글리신(치환: 1.0 m㏖/g)을 이용하여 사전 로딩하였다. 상기 수지를 로딩하는 대신에, 용매로서 디메틸포
름아미드를 이용하고 3 당량의 아미노산 및 커플링 시약을 이용한 HBTU/HOBt법을 이용하여, 2-(1H-벤조트리아졸
-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트/N-하이드록시벤조트리아졸의 결합을 달성하였다. 그런
다음, 디메틸포름아미드 내에 20%의 피페리딘을 이용하여 15분간 처리함으로써 상기 Fmoc기를 제거하였다. BOP
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활성화 반응을 이용하여 전술한 바와 같이 5-(4-포르밀-3-하이드록시페녹시)펜탄산(BAL)(16)의 커플링을 달성하
였다. 상기 BAL의 2-하이드록시기 위치에 형성된 임의의 에스테르를 제거하기 위해, 최종 20%의 피페리딘 처리를
수행하였다. 최종적으로, 디클로로메탄 내에 5%의 트리플루오로아세트산을 이용하여 각각 5분간 몇 회 처리함으로
써, 상기 수지로부터 펩티드를 분리시켰다. 그런 다음, 상기 수지를 여과 공정에 의해 제거하고, 수집한 여과물을 질소
분사하면서 농축시켰다. 이렇게 하여 얻어진 조생성물을 석출하고, 차가운 메틸 tert-부틸에테르로 세척한 다음, 50
%(수용액) 아세토니트릴에 재용해하여, 동결 건조하였다. 끝으로, 상기 화합물을 세미 프리패러티브 RP-HPLC에 의
해 정제한 다음, 순수한 분획물을 채집하여 1회 더 동결 건조시켜, 백색의 고체를 얻었다. 수율: 49 ㎎, 0.095 m㏖, 3
2%. ESI-MS m/z: 520.2(calc. for M H 520.1). HPLC 유지 시간: 5.12분.
G. [2S-[5-(4-포르밀-3-하이드록시페녹시)펜타노일아미노]-6-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노 )헥사노일아
미노]아세트산 2,5- 디옥소피롤린 -1-일 에스테르( Tfa - OSu )(19).
화합물(18)(49 ㎎, 0.095 m㏖)을 디메틸포름아미드(2 ㎖) 내에 용해한 다음, 디클로로메탄(10 ㎖) 내에 PS-카르보디
이미드(375 ㎎, 0.475 m㏖)의 교반 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분간 교반한 다음, 디메틸포름아미드(1 ㎖)
내에 용해한 N-하이드록시숙신이미드(11㎎, 0.095 m㏖)를 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응물을 실온에서 교반하
고, 반응이 완료될 때까지(5시간) HPLC에 의해 모니터링하였다. 상기 수지를 여과 공정에 의해 제거하고, 용매를 진
공 제거한 다음, 추가의 정제 공정을 수행하지 않고 상기 화합물을 이용하였다. 수율: 55 ㎎, 0.089 m㏖, 93%. ESI-
MS m/z: 617.2(calc. for M H 617.1). HPLC 유지 시간: 5.64분.
실시예 2 - BSA 링커 구조체를 이용한 용해도 연구
Fluram 분석.
이염기성 인산수소나트륨 버퍼(85 ㎕)를 포함하는 분석 플레이트 웰에 테스트 샘플 또는 표준(10 ㎕)을 첨가하였다.
Fluram을 아세토니트릴(1 ㎎/㎖)에 용해 한 다음, 그 용액 5 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여 혼합한 뒤, 5분간 반응시켜,
형광 기록을 얻었다.
BSA 아실화 반응의 양론적 평가.
BSA를 0.1 M의 소듐 아세테이트(pH 7.25)에 용해하여, 10 ㎎/㎖의 용액을 얻고, 160 ㎕의 이염기성 인산수소나트륨
버퍼(0.1 M, pH 8.2)를 포함하는 (3개의) 웰로 상기 용액 10 ㎕를 이동시켰다. 그런 다음, 상기 샘플 85 ㎕를 2배 희
석법을 이용하여 플레이트를 거쳐 이염기성 인산수소나트륨 버퍼로 이동시켰다. Fluram을 아세토니트릴(20 ㎍/㎖)에
용해시킨 다음, 얻어진 용액 5 ㎕(0.1 ㎍, 359 p㏖)를 각각의 웰에 첨가하고 혼합하여, 5분간 반응시킨 후, 형광 기록
을 얻었다.
BSA-링커 구조체(20, 21, 22)의 제조.
BSA(2 ㎎, 29 n㏖)을 0.1 M의 소듐 아세테이트(1 ㎖, pH 7.25)에 용해하고, 각각 디메틸 설폭사이드(0.5 ㎖)에 용해
시킨 BAL-OSu(17)(2.5 ㎎, 7.46 m㏖), Tfa-OSu(19)(4.6 ㎎, 7.46 m㏖) 또는 TML-OSu(15)(4.2 ㎎, 7.46 μ㏖)에
첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 교반하고, Fluram을 이용하여 유리 아민의 소멸을 모니터링하였다. 일단 반응이
완료되면(약 2 내지 3 시간), 상기 반응 혼합물을 10 mM의 암모늄 바이카보네이트(pH 8)에 대해 투석하고(3×2 ℓ),
얻어진 생성물을 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
브래드포드 분석.
표준 BSA 용액(0.5 ㎎/㎖)을 제조하고, 물을 포함하는 웰에 다양한 부피 범위(0∼15 ㎕)로 첨가하여, 총 부피가 100
㎕가 되도록 하였다. 이와 유사한 방법 으로, 5 ㎕의 테스트 샘플을 물(95 ㎕)을 포함하는 (3개의) 웰에 첨가하였다.
그런 다음, 브래드포드 시약(100 ㎕)을 상기 표준 웰 및 테스트 웰에 첨가하고, 다중 채널 피펫을 이용하여 상기 용액
을 혼합하였다. 이어서, 상기 플레이트를 실온에서 5분간 방치한 다음, UV 측정을 수행하였다. 그리고, BSA에 대해
형성된 표준 곡선과 비교하여 단백질 농도를 결정하였다.
pH 8에서의 BSA-링커 구조체(20, 21, 22)의 용해도 측정.
암모늄 바이카보네이트 버퍼 내에 1 ㎖의 BSA-링커 구조체(20, 21, 22)를 원심 여과함으로써 상기 구조체 원래 부
피의 약 5분의 1로 농축시키고, 브래드포드 분석법에 따라 단백질 농도를 평가하였다. (21)로부터 유래된 제제의 농
도를 4 ㎎/㎖로 조정하면서, 상기 BSA-링커 구조체 (20) 및 (22)의 농도를 5 ㎎/㎖로 조정하였다. 각각의 용액 40 ㎕
를 384-웰 마이크로티터 플레이트의 (3개의) 웰로 이동시키고, 각각의 샘플 20 ㎕를 2배 희석법을 이용하여 플레이
트를 거쳐 암모늄 바이카보네이트 버퍼로 이동시켰다. 상기 샘플을 30분 이상 평형 상태가 되도록 한 다음, 상기 샘플
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의 혼탁도를 측정하였다.
pH 4.5에서의 BSA-링커 구조체(20, 21, 22)의 용해도 측정.
암모늄 바이카보네이트 버퍼 내에 부피 1 ㎖의 BSA-링커 구조체(20, 21, 22)를 원심 여과함으로써 상기 구조체 원래
부피의 약 5분의 1로 농축시켰다. 그런 다음, 용매 교환 과정 시에 여과기를 이용하고, 원래의 암모늄 바이카보네이트
버퍼를 소듐 포르메이트 버퍼(0.1 M, pH 4.5)로 대체하였다. 이는 새로운 버퍼(약 5∼6 사이클)를 이용하여, 암모늄
바이카보네이트의 이론적 함량이 1% 미만이 될 때 까지 희석 사이클 및 농축 공정을 수행함으로써 얻어진다. 그런 다
음, Brad 분석법을 이용하여 상기 농축 제제(포르메이트 버퍼 내의)의 단백질 함량을 분석한다. 각각의 용액 40 ㎕를
384-웰 마이크로티터 플레이트의 (3개의) 웰로 이동시키고, 각각의 샘플 20 ㎕를 2배 희석법을 이용하여 플레이트를
거쳐 소듐 포르메이트 버퍼(0.1 M, pH 4.5)로 이동시켰다. 상기 샘플을 30분 이상 평형 상태가 되도록 한 다음, 상기
샘플의 혼탁도를 측정하였다.
결과 및 토의
BSA-링커 구조체(20∼22)의 용해도. 소 혈청 알부민(BSA) 캐리어 단백질 내의 유리 아민의 대략의 개수를 분석하
기 위해, 접합법은 아민 특이성 형광 시약(Fluram)과 BSA 간의 반응을 양론적으로 평가하는데 적절하다. 1개의 반응
상수를 유지시키고, 나머지는 점진적으로 증가시킴으로써, 등량점을 가리키는 평탄면에 도달하였다(도 1). 상기 BSA
내 유리 아민의 개수가 알려져 있기 때문에, 반응에 참가한 유리 아민의 개수를 추측할 수 있다(대략 21∼25).
먼저, 접근 가능한 표면 아민의 로딩도가 약 85%∼90%가 되도록, 활성화된 링커(15, 17, 19)와의 결합을 통해, TML
85 (20), Tfa85 (21) 및 BAL85(22)를 포함하는 3개의 BSA-링커 구조체를 제조하였다(Fluram 모니터링에 따른 평
가). 상기 BSA 개질된 구조체의 특성을 겔 전기영동법을 이용하여 확인한 결과, 천연 BSA에 비해 분자량이 증가하였
음을 확인하였다(도 2).
상기 BSA-TML85(20) 구조체를 통해, 양호하게 개질된 단백질이 pH 범위에 걸쳐 양호한 수성 용해도를 유지하였음
을 확인할 수 있는데 반해, BAL 및 Tfa 링커로 부터 유래된 BSA 구조체는 거의 용해되지 않았다. pH 8에서, BSA-T
fa85(21)가 약 0.5 ㎎/㎖의 농도에서 석출된 한편, BSA-TML85(20) 및 BSA-BAL85(22)를 통해, 약 2∼3 ㎎/㎖에
서의 용해도가 상당히 양호하였다(도 3).
더욱 산성인 조건(pH 4.5)에서 BSA-BAL85(22) 및 BSA-Tfa85(21)는 낮은 용해도를 나타내었으며, 250 ㎍/㎖보다
큰 농도에서 석출된 반면, BSA-TML85(20)는 3.5 ㎎/㎖보다 바로 높은 농도에서 용해성을 나타내었다(도 4). 이는
특히, 전술한 바와 같이, 구조체와 에피토프 사이의 접합 반응이 산성 pH에서(이상적으로는 pH 4 내지 4.5에서 수행
됨) 화학 선택적이기 때문에, 중요한 발견이다. 그러므로, 산성 조건에서 BSA-링커 구조체의 불량한 용해도는 로딩
도가 높은 BSA 접합체의 형성에 있어 대단히 불리하다.
실시예 3 - BSA - 링커 - 에피토프 구조체를 이용한 용해도 연구
BSA - 링커 구조체 (23)의 제조.
BSA(2 ㎎, 29 n㏖)을 0.1 M의 소듐 아세테이트(1 ㎖, pH 7.25)에 용해하고, 각각 디메틸 설폭사이드(0.5 ㎖)에 용해
시킨 BAL-OSu(17)(2.5 ㎎, 7.46 m㏖)에 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 교반한 다음, 약 55%의 아실화 반응
이 얻어질 때까지 Fluram을 이용하여 유리 아민의 소멸을 모니터링하였다(약 2 시간). 상기 반응 혼합물을 10 mM의
암모늄 바이카보네이트(pH 8)에 대해 투석하고(3×2 ℓ), 얻어진 생성물을 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
BSA-링커 구조체(20, 23) 제공 접합체(24, 27)에 대한 에피토프(13)의 히드라존 접합체
암모늄 바이카보네이트 버퍼 내에 2 ㎖의 BSA-링커 구조체 (20) 및 (23)을, 최종 농도가 약 1 ㎎/㎖가 되도록 소듐
포르메이트 버퍼(0.1 M, pH 4)에 대해 투석하였다(3×4 ℓ). 옥시토신 유사체(13)(2.6 ㎎, 2.1 μ㏖)를 디메틸 설폭사
이드(1.6 ㎖)에 용해하고, 상기 BSA-링커 구조체 용액(2 ㎖)을 첨가하여, 상기 디메틸 설폭사이드의 최종 함량이 약
45%가 되도록 하였다. 상기 용액을 실온에서 18 시간 동안 교반하고, 10 mM의 PBS(pH 7.4)에 대해 투석하였다(3×
2 ℓ). 이렇게 하여 얻어진 접합체 (24) 및 (27)의 특성을 겔 전기영동법에 따라 분석하였다.
BSA 접합체 (24, 27)의 용해도 측정.
선택된 pH에서 부피가 1 ㎖인, 10 mM 포스페이트 버퍼 내의 BSA 접합체(24, 27)를 원심 여과함으로써 상기 접합체
원래 부피의 약 5분의 1로 농축시킨 다음, 브래드포드 분석법을 이용하여 농축한 제제의 단백질 함량을 측정하였다.
각각의 용액 40 ㎕를 384-웰 마이크로티터 플레이트의 (3개의) 웰로 이동시킨 다음, 각각의 샘플 20 ㎕를 2배 희석
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법을 이용하여 상기 플레이트를 거쳐 포스페이트 버퍼로 이동시켰다. 상기 샘플을 30분 이상 평형 상태가 되도록 한
다음, 상기 샘플의 혼탁도를 측정하였다.
결과 및 토의
BSA - 링커 - 에피토프 접합체 (24 ∼ 27)의 제조 및 용해도.
신경뇌하수체 호르몬인 옥시토신은 디설파이드 억제된 노나펩타이드(사이클로-[CYIQNC]PLG)이며, 접합 및 면역
화 연구를 수행하는데 이용되는 에피토프 모델로서 선택된다. 통상적으로, BSA-링커 구조체(20∼22) 및 에피토프(1
3) 사이의 접 합 반응은 pH 4∼4.5의 수성 버퍼/디메틸 설폭사이드 배지 내에서 수행된다. 접합이 용이한 큰 몰수의
알데히드에 있어서, 2 내지 3 당량의 옥시토신 유사체 히드라지드(13)를 이용하여 로딩 반응을 수행한 지 약 18 시간
후에 반응을 완료하였다. 상기 BSA-Tfa85(21) 구조체의 불량한 용해도로 인해 접합체 BSA-Tfa85-에피토프13(25
)을 형성하는 것이 어렵기 때문에, 먼저 접합체 BSA-TML85-에피토프13(24) 및 BSA-BAL85-에피토프13(26)만
을 적절히 제조하였다. 그런데, 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 투석 시에, BSA-BAL85-에피토프13(26)으로부터 얻어
진 접합체는 석출 및 응집이 일어나 용해성이 매우 불량해진다. 이에 반해, 접합체 BSA-TML85-에피토프13(24)은
그 용액 내에 단독의 미미한 석출물만이 관찰된 것으로 보아, 비교적 가용성을 유지하였다. 면역화 연구를 진행하기
위해서는 BAL 링커(17)에 기초한 가용성 접합체가 필요하며, 이러한 접합체로서, BSA-BAL55 (23)를 통해서 약 55
%의 표면 로딩 감소율을 갖는 BSA-BAL55-에피토프13(27)을 얻었다. 용해도 연구를 통해 상기 BSA-TML85-에
피토프13(24) 및 BSA-BAL55-에피토프(27) 접합체가 pH 6 및 pH 7.4에서 약 0.5∼1 ㎎/㎖의 양호한 용해도를 가
짐을 확인하였다(도 5 및 도 6).
겔 전기영동법을 이용하여, 천연 BSA에 비해 분자량이 증가하였음을 확인하였다(도 7).
실시예 4 - BSA - 링커 - 에피토프 구조체의 화학적 분석
BSA-TML-옥시토신 접합체(24)의 가수분해.
동일 부피의 접합체 및 1N의 염산을 혼합하고, LC-MS법에 따라 15분마다 분석하였다.
결과 및 토의
BSA-TML85-에피토프13 접합체(24)의 가수분해. 근본적으로, 캐리어 단백질과 에피토프 간 결합의 가역성은 접합
체 생성 공정의 질적 제어에 있어서 결정적이다. 로딩된 에피토프의 화학적 통합이 접합 이후의 일들에 대해 확정할
수 없다면, 그 접합체를 이용하는 경우에 얻어지는 임의의 결과의 타당성에 대해서는 주의를 기울여 처리해야 한다.
BSA-TML85-에피토프 13 접합체(24)에서 히드라존 결합의 산 가수분해 반응을 통해 BSA-TML85(20) 및 에피토
프(13)가 재형성되었다. 상기 반응은 LC-ESI-MS법에 따라 동일한 에피토프(13)를 이용하여 1시간에 걸쳐 원활하게
진행되었다(도 8). Ellman 시약을 이용하여 상기 가수분해 생성물 내에 유리 티올에 대한 분석을 수행한 결과, 음성으
로 확인되었으며, 에피토프(13) 내의 디설파이드 결합의 통합성을 확인할 수 있었다.
실시예 5 -면역화 연구
50 ㎍의 BSA 단독으로, 또는 BAL 링커 또는 TML 링커 중 하나를 이용하여 BSA에 접합된 옥시토신을 이용하여 완
전한 Freund 항원 보조제 내에서 마우스들을 면역시켰다. 그런 다음, 면역시킨 지 14일 및 28일 째에 마우스들에 불
완전한 Freund 항원보조제 내에 적절한 화합물 50 ㎍을 추가로 투여한 뒤, 면역시킨 지 42일 째에 채혈하였다. Nunc
-immuno 플레이트에서 ELISA 분석을 수행하고, 유리 옥시토신 펩타이드로 코팅하였다. 차단 용액으로서 카세인을
이용하여, 항체와 상기 마이크로티터 플레이트 간의 비특이적 상호 반응을 방지하였다. 디소듐 p-니트로 페닐 포스페
이트와 함께 알칼리성 인산분해효소가 결합된 항-마우스 IgG 2차 항체를 이용하여 상기 플레이트를 전개하고, 405
㎚의 파장에서 각각의 웰의 흡광도를 판독하였다.
그 결과를 도 9 내지 도 11에 도시한다. 도 9는 BSA가 두 구조체 내에 존재하는 캐리어 단백질이기 때문에 BSA 단독
으로 증가시킨 항체에 의해 두 구조체를 확인할 수 있으므로, 양성 대조군으로 제공된다.
상기 BSA-BAL55-옥시토신 구조체 및 상기 BSA-TML85-옥시토신 구조체에 대해 증가한 항체가를 비교한 결과,
생성된 항체의 특성에서 분명한 차이가 나타났다. 상기 BSA-BAL55-옥시토신 구조체를 이용하여 면역시킨 마우스
로부터 얻은 결과를 통해, 전체 구조체 자체에 대해 특이성이 있는 항체에 비해, 생성된 BSA(비특이성) 항체의 비율
이 더 크게 나타남을 알 수 있다(도 10). 한편, 상기 BSA-TML85-옥시토신 구조체를 이용하여 면역시킨 마우스는
전술한 바와 반대되는 결과, 즉, 전체 구조체로 증가된 특정 항체의 비율이 비특정 BSA 역가보다 더 크게 나타났다.
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이러한 결과로부터, 상기 TML85 구조체가 상기 BAL55 구조체에 비해 에피토프 표면 적용범위 및 수성 용해도가 더
크다는 것을 확인할 수 있다. 이는 전술한 실시예 1 내지 실시예 4의 결과에 의해 뒷받침된다.
실시예 6 . TML 링커 (14)의 제조 및 상기 링커와 단백질의 반응에 있어서의 분광학적 특성
(a) 각종 단백질과 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물을 제공하는 TML 링커(14)의 화학적 결합
별도의 언급이 없다면, 본 실시예에 사용된 모든 단백질은 Sigma Chemical Company(Poole, Dorse)에서 구입한 것
이다. 아프로티닌(APRO; cat# A4520), HEWL(HEWL; cat # L6876), 탄산 탈수효소(cat # C2273), 오브알부민(OV
A; cat # A7642), 소 혈청 알부민(BSA; cat # A7638), 아포-트랜스페린(cat # T4382); 홀로-트랜스페린(cat # T4
132); 인산화효소 B(phosB; cat # P4649), β-갈락토시다아제(β-gal; cat # G8511) 및 마이오신(MYO; cat # M3
889)을 pH 9.3에서 50 mM의 포타슘 포스페이트 내에 1 ㎎/㎖ 이하로 제조하였다. 보정 대조군으로서 Fmoc-Lys-O
H(Novabiochem)을 이용하고 Fluram 분석법(전술한 바와 같음)을 이용하여, 각각의 단백질 샘플에 대한 반응성 아
민의 양을 측정하였다. 이렇게 하여 얻은 자료를 이용하여, 각각의 단백질에 대한 반응성 아민의 양론을 결정하였다.
DMSO 내에 다양한 양의 10 mM TML-NHS(15)를, pH 9.3에서 50 mM의 포타슘 포스페이트에 용해시킨 각각의 단
백질 1 ㎎/㎖ 용액 200 ㎕와 혼합하여, TML 링커(14)를 각각의 단백질에 결합시켰다. 그런 다음, 아프로티닌에 438
㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; HEWL에 135 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 탄산 탈수효소에
38 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 오브알부민에 42 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; BSA에 65
㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 아포-트랜스페린에 80 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 홀로-트
랜스페린에 80 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 인산화효소 B에 15 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하
고; β-gal에 71 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하고; 마이오신에 100 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하였
다. 상기 샘플을 실온에서 60분간 배양한 다음, 밤새 냉장 배양하였다(∼8℃).
상기 TML-NHS(15)-단백질 반응 혼합물을 추가의 처리를 위해 등부피의 3부분으로 나누었다. pH 7.25에서 10 mM
의 소듐 아세테이트 1800 ㎖의 3회 교환을 한 배치(batch)로 하여, 각각의 TML-NHS(15)-단백질 반응 혼합물 중 한
부분을 벤조일화 투석 튜빙(SpectraPor 1.2 kDa 절단막; Sigma cat # D2272) 내에서 투석하였다. 처음의 두 과정을
60분간 수행하고, 이어서 각각에 대해 밤새 추가의 투석 사이클을 수행하였다. 그런 다음, pH 4.0에서 10 mM의 소듐
포르메이트 1800 ㎖의 3회 교환을 한 배치로 하여, 상기 샘플을 60분간 투석하였다. 상기 샘플을 회수한 뒤, 이용 시
까지 냉장 보관하였다.
(b) B형 간염 바이러스 코어 델타 항원(HBV 코어 델타 Ag)과 TML 링커(14)의 화학적 결합 및 상기 델타 항원과 바
이오틴 히드라지드의 반응
재조합 HBV 코어 델타 Ag인 균주 ayw를 Advanced ImmunoChemical Inc.(USA, CA, Long Beach 소재)로부터 구
입하였다. HBV 코어 델타 Ag의 1 ㎎/㎖ 용액 75 ㎕에 pH 9.3에서 7.5 ㎕의 0.5M 소듐 포스페이트를 첨가하였다. 상
기 샘플을 혼합하고, 채집한 것으로 일정 부분(55 ㎕)을 제거한 다음, 제거된 일정 부분에 5.5 ㎕의 10 mM TML-NH
S(15)를 첨가하고, 피펫을 이용하여 상기 샘플을 혼합한 후, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이와 같이 배양한 다음
, 27.5 ㎕를 추가로 제거하고, 상기 샘플에 2 ㎕의 2.65 M 포름산을 첨가하였다. 상기 샘플을 혼합하고, 상기 샘플에
1.37 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지를 첨가하였다. 상기 샘플을 실온에서 60분간 배양한 다음, ∼8℃에서 밤새 방
치하였다. 각종 단백질 샘플을 하기와 같은 방 법에 따라 분석하였다.
(c) TML-표지화된 단백질의 겔 분석.
상기와 같이 투석시킨 TML-NHS(15)-단백질 샘플을 회수하고, MES 러닝 버퍼와 함께 4∼12%의 비스-트리스 Nu
PAGE 겔을 이용하는 NuPAGE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 SDS-PAGE에 따라 분석하였다. SilverExpress 염색
키트를 이용하여 단백질을 가시화하였다. 제조 설명서에 따라 상기 프로토콜을 수행하였다(도 14).
(d) UV 측정용 BSA- 및 아프로티닌- TML 접합된 단백질의 제조
BSA(20 ㎎)를 pH 9.3에서 2 ㎖의 50 mM 포타슘 포스페이트에 용해하고, 상기 샘플을 pH 9.3에서 5 ℓ의 50 mM
포타슘 포스페이트에 대해 실온에서 60분간 투석하였다(10 kDa 분자량 절단, Slidealyser; Perbio). 상기 단백질 샘
플을 회수하고, 교반하면서 100%의 DMSO 내 200 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하였다. 상기 샘플을 실온에
서 20분간 교반한 다음, 추가로 200 ㎕의 TML-NHS(15)를 첨가하고 샘플을 교반하였다. 그리고, 20분 후에 234 ㎕
의 TML-NHS(15)를 추가로 첨가한 다음, 상기 샘플을 30분간 더욱 교반하였다. 상기 TML-NHS(15) 처리된 샘플을
회수하여, pH 3.5에서 5 ℓ의 100 mM 소듐 포르메이트에 대하기 전에 60분간 투석하였다. 상기 단백질-TML 샘플
을 회수하고(∼3 ㎖), 13,000 r.p.m.에서 10분간 원심분리한 다음, 그 상청액을 수집하였다. 상기 상청액을 BSA-TM
L 샘플로서 처리하였다.
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아프로티닌(2 ㎎)을 pH 9.0에서 2 ㎖의 50 mM 포타슘 포스페이트에 용해하고, 상기 샘플을 pH 9.0에서 5 ℓ의 50
mM 포타슘 포스페이트에 대해 실온에서 밤 새 투석하였다(1 kDa 분자량 절단, SpectraPor; Sigma). 상기 단백질 샘
플을 회수하여(∼1.8 ㎖), 교반하면서 100%의 DMSO 내 100 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하였다. 상기 샘플
을 실온에서 120분간 교반한 다음, pH 3.5에서 5 ℓ의 100 mM 소듐 포르메이트의 2회 교환 이전에, 각각 60분, 및
120분간 투석하였다. 상기 단백질-TML 샘플을 회수하고(∼3 ㎖), 13,000 r.p.m.에서 5분간 원심분리한 다음, 그 상
청액을 수집하였다. 상기 상청액을 아프로티닌-TML 샘플로서 처리하였다.
(e) TML 링커(14) 접합된 단백질의 흡광 스펙트럼 특성
pH 6.0 내지 pH 11.0 범위의 50 mM 포타슘 포스페이트 190 ㎕을 이용하여, BSA-TML 및 아프로티닌-TML의 부
분 표본(10 ㎕)을 희석하였다. 상기 버퍼에 적절한 비율의 50 mM 디-포타슘 하이드로전 포스페이트 및 50 mM 포타
슘 디-하이드로전 포스페이트를 혼합함으로써, 필요로 하는 pH로 제조하였다. 필요 시에는, 수산화나트륨을 이용하
여 상기 버퍼의 pH를 조정하였다. Spectramax384 장치(Molecular Devices, UK, Crawley)를 이용한 UVStar 96-
웰 마이크로티터 플레이트(Greiner)에서 흡광 스펙트럼 데이터를 수집하였다(도 12 참조).
(f) TML 링커(14) 접합된 단백질의 형광 스펙트럼 특성
pH 12.0 범위의 500 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 190 ㎕를 이용하여, 투석 후의 버퍼(100 mM 소듐 포르메이트; pH
3.5), BSA-TML 및 아프로티닌-TML의 부분 표본(10 ㎕)을 희석하였다. Gemini 장치(Molecular Devices,U.K., Cr
awley)를 이용한 Microfluor W 96-웰 마이크로티터 플레이트(Thermo Dynex)에서 형광 스펙트럼 데이터를 수집하
였다(도 13 참조).
실시예 7 . 단백질 구조체(XV)의 제공을 위한 링커-단백질(XIV)에 대한 리간드의 화학 선택적 첨가 반응
(a) 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 제공하며 일반식 (XIV)로 표시되는 단백질-TML 화합물과 바이오틴 히드라지
드의 반응.
상기 각각의 단백질-TML 반응 혼합물(예: 실시예 6(a))의 10 mM 소듐 포르메이트(pH 4.0)으로 투석된 부분에 다양
한 양의 10 mM 바이오틴-히드라지드(Aldrich cat # 14403; DMSO 내)를 첨가하였다. 그리고, 133 ㎕의 아프로티닌
-TML 반응 혼합물에 26.6 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하고; 112 ㎕의 HEWL-TML 반응 혼합물에 2
2 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하고; 79 ㎕의 탄산 탈수효소-TML 반응 혼합물에 15 ㎕의 10 mM 바이
오틴-히드라지드를 첨가하고; 80 ㎕의 오브알부민-TML 반응 혼합물에 15 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨
가하고; 88 ㎕의 BSA-TML 반응 혼합물에 15 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하고; 71 ㎕의 인산화효소
B-TML 반응 혼합물에 15 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하고; 90 ㎕의 β-gal-TML 반응 혼합물에 15
㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하고; 및 66 ㎕의 마이오신-TML 반응 혼합물에 15 ㎕의 10 mM 바이오틴
-히드라지드를 첨가하였다. 상기 샘플을 실온에서 60분간 배양한 다음, 7일간 냉장 보관하였다(∼8℃).
트랜스페린 실험에 있어서, 둘다 50 mM 포타슘 포스페이트(pH 9.0) 내의 140 ㎕의 아포-트랜스페린-TML 및 140
㎕의 홀로-트랜스페린-TML에 140 ㎕의 0.2 M의 소듐 포르메이트(pH 4.0)을 첨가하였다. 상기 샘플을 혼합하고, 상
기 두 샘플에 100 ㎕의 10 mM 바이오틴-히드라지드를 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 시간 동안 배양한 다음,
∼8℃에서 밤새 추가 배양하였다.
이와 같이 배양한 다음, 모든 반응 혼합물을 회수하여, 각각 벤조일화 투석 튜빙(SpectraPor 1.2 kDa 절단막; Sigma
cat # D2272) 내에서 4000 ㎖의 20 mM 소듐 아세테이트(pH 7.4)에 대해 실온에서 120분간 투석하였다. 상기 샘플
을 회수한 뒤, 다시 이용할 때까지 냉장 보관하였다.
(b) 단백질-TML-바이오틴 구조체(XV)의 겔 이동 및 웨스턴 블롯 분석
상기와 같이 투석시킨 단백질-TML-바이오틴 샘플(예: 실시예 7(a))을 회수하고, MES 러닝 버퍼와 함께 4∼12%의
비스-트리스 NuPAGE 겔을 이용하는 NuPAGE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 SDS-PAGE에 따라 분석하였다. No
vex 블롯 트랜스퍼 시스템(Invitrogen)을 이용하여, 단백질을 PVDF막 상으로 이동시켰다. 제조 설명서에 따라 상기
프로토콜을 수행하였다(도 14).
1%(w/v)의 BSA를 함유하는 1%의 Tween 20 (PBST; Sigma cat # P3563)을 포함하는 50 ㎖의 포스페이트 완충
식염수 내에서 상기 PVDF막을 15분간 서서히 교반함으로써, PVDF막을 블로킹하였다. 회수한 막을 100 ㎖의 PBST
내에서 매 사이클 당 5분간 교반하여, 3회 세척하였다. 그런 다음, 회수한 막을 ExtrAvidin (R)-Peroxidase(Sigma
E2886)의 1:5000 희석액을 포함하는 50 ㎖의 PBST 내에서 30분간 배양하였다. 상기 막을 회수하여 PBST 내에서
3회 세척한 다음, 부분적으로 드립 건조(drip-dry)하였다. 정지상 막 상에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 액상 기
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질(Sigma cat # T0565)을 첨가하여, 과산화효소 활성 영역을 육안으로 확인할 수 있도록 하였다. 상기 영역을 적절
히 노출시킨 다음, 상기 막을 회수하고 물로 세척한 후, 대기 중에서 건조시켜 분석 및 보관하였다(도 14 및 도 15 참
조).
(c) TML 활성화 단백질의 Texas Red (R)표지화
상기와 같이 투석시킨 단백질-TML 샘플(예: 실시예 6(a))을 회수하고, 각각의 10 ㎕ 샘플에 2 ㎕ DMSO 및 1 ㎕의 1
0 mM Texas Red (R)-히드라지드(Molecular Probes)를 첨가하였다. 상기 샘플을 혼합하고, 실온에서 3시간 동안
배양하였다. 그런 다음, 2.5 ㎕의 샘플 로딩 버퍼(Novex) 및 1.25 ㎕의 샘플 환원 버퍼(Novex)를 각각의 샘플에 첨가
하였다. MES 러닝 버퍼와 함께 4∼12%의 비스-트리스 NuPAGE 겔을 이용하는 NuPAGE 시스템(Invitrogen)을 이
용하여 SDS-PAGE에 따라 분석하였다. 제조 설명서에 따라 상기 프로토콜을 수행하였다. 이후에는 단백질 밴드를
육안으로 관찰할 수 있었다.
(d) 일반식 (XV)로 표시되는 바이오틴 유도화된 화합물의 ELISA 분석
바이오틴-히드라지드와 반응시킨 BSA-TML 및 아프로티닌-TML 샘플에 대한 효소면역측정법(ELISA)을 하기와
같이 수행하였다. 각각의 켄칭된 샘플 중 부분 표본(1 ㎕)을 500 ㎕의 10 mM 포스페이트 버퍼 식염수(PBS; Sigma)
로 희석하고, 그 중 100 ㎕를 96-웰 Immulon 2HB 마이크로티터 플레이트(Thermo Life Sciences, Basingstoke, U
.K.)에 공급하였다. 상기 플레이트를 덮고, 37℃에서 60분간 배양한 다음, 매 사이클마다 Tween 20(PBST; Sigma)
을 포함하는 200 ㎕의 PBS로 3회 세 척하였다. 상기 플레이트를 진동시켜 수동 건조시키고, 각각의 웰에 ExtrAvidin
-HRP 접합체(Sigma)의 5000분의 1 희석액 100 ㎕를 첨가하였다. 상기 플레이트를 덮고, 37℃에서 30분간 배양하
였다. 상기 플레이트를 회수하여, 전술한 바와 같이 세척하고, 진동 건조시킨 다음, 각각의 웰에 100 ㎕의 OPD 시약(
Sigma)을 첨가하였다. 육안으로 그 컬러가 확인되면, 0.1 M의 황산 100 ㎕를 첨가하여, 상기 반응을 중지시켰다. 상
기 플레이트를 파장 492 ㎚(Spectramax 384)에서 판독하여, 컬러 반응을 정량화하였다(도 18 참조).
실시예 8 . 단백질 구조체(SV)의 제공을 위한 링커-단백질(XIV)에 대한 리간드의 화학 선택적 첨가 반응의 분광학
적 분석.
BSA-TML 및 아프로티닌-TML의 부분 표본(100 ㎕)에 등부피의 10 mM 바이오틴-히드라지드(100 mM의 소듐 포
르메이트; pH 3.5에 용해시킴)을 첨가하고, 상기 반응물을 혼합하였다. 상기 샘플을 나누어서, 제1 부분을 시간의 함
수로서 흡광 스펙트럼 데이터 수집을 위해 이용하고(도 16 및 도 17 참조), 각각의 데이터 수집 후반부에 부분 표본(1
0 ㎕)을 뽑아 제2 부분을 동시에 샘플링하고, 4X LDS 버퍼(NuPAGE 로딩 버퍼; Invitrogen)으로 켄칭하였다. 켄칭한
샘플을 필요 시까지 냉동하였다(영하 20℃). 켄칭한 단백질 샘플을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE(NuPAGE 시스템)
및 웨스턴 블롯법을 이용하여 분석하였다. 겔 전기영동법 및 염색법의 수행 시에 상기 단백질 샘플들 간의 직접 비교
를 용이하게 하기 위해, 상기 BSA-TML 샘플 및 아프로티닌-TML 샘플을 적절히 혼합한 다음, 상기 겔 상에 로딩하
였다.
실시예 9 . 단백질- TML - 리간드 구조체의 분리 반응 특성.
BSA-TML-바이오틴의 부분 표본(200 ㎕)에 200 ㎕의 200 mM 포름산(pH 2.1)을 첨가하고, 상기 반응물을 혼합하
였다. 20 ㎕의 12.1 M HCl을 첨가하여 상기 샘플을 추가로 산성화하고, 상기 샘플을 혼합한 다음 나누어서, 그 중 제
1 부분을 시간의 함수로서 흡광 스펙트럼 데이터 수집을 위해 이용하고(도 20 참조), 각각의 데이터 수집 후반부에 부
분 표본(10 ㎕)을 뽑아 제2 부분을 동시에 샘플링하고, 4X LDS 버퍼(NuPAGE 로딩 버퍼; Invitrogen)으로 켄칭하였
다. 켄칭한 샘플을 필요 시까지 냉동하였다(영하 20℃). 켄칭한 단백질 샘플을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE(NuPAG
E 시스템) 및 웨스턴 블롯법을 이용하여 분석하였다(도 21 및 도 22 참조).
실시예 (10) . TML 링커(15)를 이용한 고상 표면의 유도화 및 바이오틴 히드라지드와의 반응
(ⅰ) 유리 슬라이드(Fisher Scientific; Menzel Superfrost 76×26 ㎜, ISO-Norm 8037)를 세척하고, 전술한 바와
같이, 아미노-프로필실란(Acros, cat # 15181000)을 이용하여 유도화함으로써 아민 작용화하였다(MacBeath,et al
., (1999),J. Am. Chem . Soc ., 121, 7967-7968). 상기 아민 작용화된 슬라이드를 이용 시까지 실온에서 보관하
였다.
(a) TML 링커(14)를 이용한 슬라이드 유도화
블런트 말단 주사 바늘(Rheodyne)을 이용하여 100% DMSO 내에 10 mM의 TML-NHS(15)를 상기 유리 슬라이드
표면에 점적함으로써, 아민 작용화한 슬라이드를 TML 링커로 처리하였다. 점적한 슬라이드를 덮고, 실온에서 60분
간 배양하였다. 그런 다음, ∼10 ㎖ DMSO, ∼10 ㎖ 물, ∼10 ㎖ 메탄올, ∼10 ㎖ DMSO 및 ∼10 ㎖의 10 mM 포타슘
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포스페이트(pH 7.4)를 차례로 이용하여, 상기 슬라이드를 세척하였다. 상기 TML 링커 처리된 슬라이드를 이용 시까
지 실온에서 보관하였다.
(b) 바이오틴 히드라지드를 이용한 유리-TML 링커의 유도화 반응
TML 링커 처리된 슬라이드를 0.2M의 소듐 포르메이트(pH 4, 50%(v/v) EMSO 함유) 내에 용해된 100 μM의 바이
오틴 히드라지드로 코팅하였다. 상기 슬라이드를 덮고 실온에서 30분간 배양하였다. 그런 다음, 상기 슬라이드를 다
시 덮고, 물(∼20 ㎖), 이어서 메탄올(∼20 ㎖)을 이용하여 완전히 세척한 다음, 매 사이클마다 40 ㎖의 메탄올 내에서
2분간 2회에 걸쳐 음파 처리하였다. 상기 슬라이드를 회수한 다음, 실온에서 15분간 상기 슬라이드의 중앙에 1M의 H
Cl 한 방울을 적하하였다. 물로 세척된 슬라이드를 대기 중에서 건조시키고, ExtrAvidin-HRP 접합체(Sigma)의 1:50
00 희석액을 함유하는 50 ㎖의 PBST를 포함하는 50 ㎖ Falcon관 내로 삽입하였다. 상기 관을 실온의 롤러 베드 상
에서 15분간 서서히 롤링하였다. 상기 슬라이드를 회수하고, 40 ㎖의 PBST 내에서 매 사이클 당 5분간 3회 세척하였
다. 상기 슬라이드를 회수하여 물로 세척한 다음, 대기 중에서 건조시켰다. 약 1 ㎖의 TMB 액체 과산화효소 기질(Sig
ma)를 슬라이드 상에 적하하고, 육안으로 그 컬러를 관찰하였다(도 23 참조).
(ⅱ) 96-웰 플레이트의 유도화 반응
(a) TML 링커(14)를 이용한 Reacti-Bind 마이크로티터 플레이트의 유도화
60%의 DMSO(v/v)를 함유하며, 5%의 탄산나트륨 내에 1 ㎎/㎖의 용액으로서 1,4-디아미노부탄을 37℃에서 2시간
동안 커플링함으로써, 말레산 무수물 활성화된 폴리스티렌 96-웰 마이크로티터 플레이트(Reacti-Bind Plates, Perb
io Sciences UK Ltd., Tattenhall, U.K.)의 웰을 아민 작용화하였다. DMSO, 물 및 5%의 탄산나트륨을 이용하여 충
분히 세척한 다음, 50%(v/v)의 DMSO를 함유하는 0.1M의 소듐 아세테이트(pH 7.25) 내 활성화된 링커의 5 mM 용
액을 이용하여, 실온에서 2시간 동안, 앞서 아민 작용화된 임의의 웰에 TML-NHS 링커(15)를 커플링시켰다. 상기 아
민 작용화된 웰의 일 부분을 50%(v/v)의 DMSO를 함유하는 0.1M의 소듐 아세테이트(pH 7.25)만으로 이루어진 블랭
크 용액으로 처리하여 대조군을 얻었다. 그런 다음, 다량의 DMSO, 0.1M의 소듐 아세테이트(pH 7.25) 및 물을 이용
하여 상기 웰을 1회 더 세척하고, 이용 시까지 실온에서 보관하였다.
(b) 바이오틴 히드라지드를 이용한 TML 링커 작용화된 Reacti-Bind 마이크로티터 플레이트의 유도화
50%의 DMSO(v/v)를 함유하며, 0.2 M의 소듐 포르메이트(pH 3.5) 내에 1 mM의 용액으로서 TML 링커 작용화된 R
eacti-Bind 플레이트에 바이오틴 히드라지드를 결합시켰다. 또한, 앞서 TML 링커로 처리하지 않은 대조군 웰에도
상기 커플링 용액을 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 방치한 후, DMSO(1×200 ㎕), 물(1×200 ㎕) 및 Tween 20(P
BST)를 포함하는 포스페이트 완충된 식염수(3×200 ㎕)를 이용하여 각각의 웰을 세척하였다. 그런 다음, 각각의 웰
에 100 ㎕의 PBST를 첨가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 30분간 배양하여, 웰 내에 임의의 미반응 부위를 블로킹
하였다. 그리고, PBST(3×200 ㎕/웰)이용하여 추가로 세척한 다음, 100 ㎕의 ExtrAvidin-HRP 접합체(Sigma)(PBS
T 내에 1:10000 희석액)를 첨가하여, 상기 웰을 37℃에서 30분간 추가 배양하였다. 그런 다음, PBST(3×200 ㎕)을
이용하여 상기 웰을 추가로 세척한 후, 100 ㎕의 o-페닐렌디아민(OPD) 과산화효소 기질(Sigma)을 첨가하였다. 육안
으로 확인할 수 있도록 비색 반응을 전개하고, 끝으로, 0.1M의 황산(100 ㎕)을 첨가하여 켄칭하였다(도 23).
실시예 11 - TML 수지를 이용하여 용액으로부터 ExtrAvidin - HRP 의 캡쳐
소결 플라스틱 칼럼 내에서 다량의 물을 이용하여 EAH 세파로즈 CL-4B(2 ㎖; 7∼12 μ㏖/㎖의 아민; APBiotech,
Amersham, U.K.)를 세척한 다음, 이어서 물:메탄올(50:50), 메탄올 및 끝으로 디메틸포름아미드(DMF)를 이용하여
세척하였다. 이와 같이 세척한 수지에 DMF 내에 900 ㎕의 10 mM TML-NHS(15)를 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반
응물을 실온에서 60분간 배양한 다음, DMF를 이용하여 상기 수지를 세척하였다.
상기 TML 처리된 수지의 부분 표본(0.5 ㎖)에 2 ㎖의 DMF 내에 바이오틴-히드라지드(4.5 μ㏖)를 첨가하였다. 상기
반응물을 실온에서 60분간 배양한 다음, PBST(∼40 ㎖)를 이용하여 상기 수지를 세척하였다.
ExtrAvidin-HRP(Sigma)의 5000분의 1 희석액 50 ㎖ 용액을 이용하여 상기 PBST 세척된 수지를 실온에서 30분간
배양하였다. 그런 다음, 상기 수지를 회수하여, 전술한 바와 같이 PBST를 이용하여 세척하였다. 상기 수지를 중력 하
에 건조시키고, 유리 피펫을 이용하여 소량의 샘플을 뽑아 Glasstic Slide 10(Hycor Biomedical, Garden Grove, CA
, U.S.A.) 현미경 슬라이드에 공급하였다. TMB HRP 기질(Sigma)의 부분 표본을 상기 슬라이드 체임버 내로 도입하
고, 컬러 반응을 전개하였다. 컬러가 전개되는 동안, 현미경(QX3 CCD 카메라 현미경; Intel)을 이용하여 이미지를 캡
쳐하였다(도 24).
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(57) 청구의 범위
청구항 1.
하기 일반식 (Ia 내지 Ie)에 따른 양전하 균형을 이룬 링커(positive charge-balanced linker), 또는 그의 염, 수화물,
용매 화합물(solvate), 착물 또는 전구약물:
(상기 일반식 Ia 내지 일반식 Ie에서,
X= O 또는 S이고;
Y는 O, S, CH 2 , CHR 또는 CRR(단, 각각의 R은 C 1-7의 알킬)이고;
Z는 O 또는 S이고;
R 1 은 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 2 는 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 4 는 상기 방향족환에서 임의의 빈 자리에 존재하는 H 또는 C 1-7의 알킬이고;
R 3 는 C 1-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH, C 3-10의 사이클로알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH 또는
Ar-C 0-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 -COOH이되,
각각의 L 1 및 L 2 가 부재이거나, 각각의 L 1 및 L 2 가 아미드 CONH와 같은 적절한 링커이거나; 또는 에테르 -O
-, 티오에테르 -S-, 또는 설폰 -SO 2 -이고;
R 5는, R 5가 양전하를 함유하도록, 각각 NR 8R 9 (질소 원자가 용액 중에서 N HR 8R 9 를 제공하도록 프로
톤화될 수 있는 것), 또는 4급 질소 원자 N R 8R 9 R 10으로 치환된 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또
는 Ar-C 0-7의 알킬이고;
R 6는 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이며,
R 8, R 9 및 R 10은 각각 독립적으로 C 1-7의 알킬, C 3-10의 사이클로알킬 또는 Ar-C 0-7의 알킬이거나, 또는
R 8, R 9 및 R 10중 2종 이상이 함께 지방족환 또는 아릴지방족환 시스템을 형성하는 것임).
청구항 2.
제1항에 있어서, 독립적으로 또는 임의의 조합으로,
X가 산소;
Y가 산소;
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R 1 이 수소, 메틸 또는 에틸;
R 2 가 수소 또는 C 1-4 의 알킬;
L 1 이 아미드(CONH); 및
L 2 가 아미드(CONH)
인 화합물.
청구항 3.
제2항에 있어서,
R 1 이 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 4.
제2항 또는 제3항에 있어서,
R 2 가 수소 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 5.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
R 3 가 하기 화학식으로 표시되는 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물:
(화학식)
(상기 화학식에서, n= 2∼6, m= 1∼3임).
청구항 6.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
NHR 5 CO(단, NH가 상기 L 1 모이어티의 일부이며, CO가 상기 L 2 모이어티의 일부임)가 프로톤화 가능한 아민
작용기 측쇄를 함유하는 간단한 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 7.
제6항에 있어서,
NHR 5 CO가 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물:
(화학식)
(상기 화학식에서,
p는 1 내지 5이고, R 8, R 9 및 R 10은 청구항 1에 정의된 바와 동일함).
청구항 8.
제7항에 있어서,
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p가 1 내지 4인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 9.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R 8, R 9 및 R 10가 각각 독립적으로 C 1-4 의 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 10.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R 6가 상기 L 2 모이어티로부터 유래된 NH기 및 말단 COOH와 결합하여 하기 화학식으로 표시되는 아미노산 잔기
를 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물:
(화학식)
(상기 화학식에서,
q 및 r이 각각 0 내지 3이되, q 및 r이 둘 다 0은 아니며;
s는 0 또는 1이고;
A는 5 내지 10원(員)의 안정한 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족환이거나, 또는 3 내지 6원의 카르보사이클릭
또는 지환식환임).
청구항 11.
제10항에 있어서,
r 및 s가 0 이고, q가 1 또는 2인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 12.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 제1항 기재의 일반식 (Ia)로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 13.
제12항에 있어서,
상기 화합물이 하기 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
(일반식 (Ⅱ))
(일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물은, X 및 Y가 O이고, R 1 이 H이며, R 2 및 R 3 가 제1항에 정의된 바와 동일한, 일반
식 (Ia)의 화합물임).
청구항 14.
제13항에 있어서,
공개특허 10-2005-0007454
- 40 -
상기 화합물이 하기 일반식 (Ⅲ)으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
(일반식 (Ⅲ))
(상기 일반식 (Ⅲ)에서,
o는 2 내지 6의 정수이고;
p는 1 내지 5의 정수이고;
R 6, R 8, R 9 및 R 10은 제1항에 정의된 바와 동일함).
청구항 15.
제14항에 있어서,
p가 1 내지 4의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 16.
제15항에 있어서,
상기 화합물이 하기 일반식 (Ⅳ)로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
(일반식 (Ⅳ))
(상기 일반식 (Ⅳ)에서, R 10= H 또는 메틸임).
청구항 17.
제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (Ⅰ)에서, L 1 및 L 2 가 CONH임)의 제조 방법으로서,
(ⅰ) 하기 일반식 (Ⅴ)로 표시되며 그의 C-말단이 고체 지지체에 결합된 화합물을, 하기 일반식 (Ⅵ)으로 표시되는 화
합물과 반응시키는 단계:
(일반식 (Ⅴ))
(상기 일반식 (Ⅴ)에서,
공개특허 10-2005-0007454
- 41 -
R 6는 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일함),
(일반식 (Ⅵ))
(상기 일반식 (Ⅵ)에서,
R 5는 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
W는 보호기임);
(ⅱ) 보호기(W)를 제거하고, 하기 일반식 (Ⅶ)로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계:
(일반식 (Ⅶ))
(상기 일반식 (Ⅶ)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 는 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
R 11 은 C 1-7의 알킬-COOH, C 3-10의 사이클로알킬-COOH 또는 Ar-C 0-7의 알킬-COOH임); 및
(ⅲ) 상기 고체 지지체로부터 생성물을 제거하는 단계
를 포함하는 방법.
청구항 18.
제17항에 있어서,
상기 일반식 (Ⅵ)로 표시되는 화합물에서, W가 우레탄 보호기인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 19.
하기 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물:
(일반식 (XIV))
공개특허 10-2005-0007454
- 42 -
(상기 일반식 (XIV)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 는 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
R 12는 C 1-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONHQ, C 3-10의 사이클로알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONHQ 또
는 Ar-C 0-7의 알킬-L 1 -R 5 -L 2 -R 6 CONH-Q이되,
L 1 , L 2 , R 5및 R 6는 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
Q는 캐리어의 일부인 잔기이고, R 12의 'NH' 모이어티가 유래된 기를 포함하거나, 또는 상기 기를 포함하도록 유도
된 것이며;
상기 캐리어는 0, 1, 2, …nn개의, 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커 분자가 부착되어 있는 복수 개의 Q 잔기
를 포함할 수 있으며; nn은 링커 분자를 특정 캐리어에 부착하는데 이용 가능한 Q 잔기의 총 개수이고, 각각의 특정
캐리어에 대해 서로 상이할 수 있음).
청구항 20.
제19항에 있어서,
Q가 단백질성 분자(proteinaceous molecule), 다당류, 셀룰로오즈 비드, 폴리머성 아미노산, 폴리머의 또는 코폴리
머, 비활성 바이러스 입자 또는 약독화 박테리아(attenuated bacteria)의 일부인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 21.
제19항 또는 제20항 기재의 화합물의 제조 방법으로서,
제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물을 캐리어와 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
청구항 22.
하기 일반식 (XV)로 표시되는 화합물:
(일반식 (XV))
공개특허 10-2005-0007454
- 43 -
(상기 일반식 (XV)에서,
X, Y, Z, R 1 , R 2 및 R 4 가 제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)에 대해 정의된 바와 동일하고;
R 12는 제19항 기재의 일반식 (XIV)에 대해 정의된 바와 동일하고;
R 13 은 (CH 2 ) t CONH-E, CONH-E 또는 G이되,
t는 1 내지 5의 정수이고;
E는 아미노기를 포함하거나 아미노기를 포함하도록 유도된 활성 모이어티로부터 유래된 것이고;
NHE는 활성 모이어티의 아미노기로부터 유래된 것이며;
G는 탄소 원자를 통해 카르보닐히드라지드에 결합된 활성 모이어티임).
청구항 23.
제22항에 있어서,
2개 이상의 활성 모이어티로부터 유래된 기 E 또는 G를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 24.
제22항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서,
제19항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물을 하기 일반식 (XVIa), 일반식 (XVIb) 또는 일반식 (XVIc)로 표시되
는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법:
(상기 각각의 일반식에서, E, G 및 t는 제22항에 정의된 바와 동일함).
청구항 25.
제22항 또는 제23항에 있어서,
상기 화합물이 수용액에 가용성인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 26.
제25항에 있어서,
공개특허 10-2005-0007454
- 44 -
상기 E 또는 G가 에피토프 또는 미모토프로부터 유래된 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 27.
제26항에 있어서,
상기 에피토프가 단백질 또는 펩타이드 분자 또는 그들의 변형체로부터 유래된 단편, 예를 들면, 항원 결정인자인 것
을 특징으로 하는 화합물.
청구항 28.
제26항 또는 제27항에 있어서,
상기 에피토프가 B 세포 또는 T 세포 에피토프인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 29.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 캐리어 단백질에 부착된, 지질, 항원보강제(adjuvant), 면역자극성 DNA 서열 및 사이토카인(cytokine
)으로부터 선택되는 다른 활성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 30.
에피토프 또는 미모토프에 대한 특정 항체를 증가시키는 방법으로서,
제26항 내지 제29항 중 어느 한 항 기재의 화합물을 이용하여 대상을 면역시키는 단계를 포함하는 방법.
청구항 31.
제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 에피토프 또는 미모토프에 대한 항체 증가를 위해 대상을 면역시키기 위한 것임을 특징으로 하는 화합
물.
청구항 32.
에피토프 또는 미모토프에 대한 항체의 증가용 약제의 제조에 이용되는, 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항 기재의
화합물의 용도.
청구항 33.
제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 백신용인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 34.
약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항 기재의 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
청구항 35.
제34항에 있어서,
상기 조성물이 백신 조성물이고, 약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적
조성물.
청구항 36.
제1항 기재의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 링커(단, 일반식 (Ⅰ)에서, R 2 는 H이고, X는 O임)와 단백질의 반응 정도 및/
또는 반응 속도를 정량화하기 위한 비파괴적 방법으로서 하기 단계 중 한 단계를 포함하는 방법:
a) 제19항 기재의 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)의 형성 여부를 검
사하기 위해, 300 ㎚보다 큰 파장 및 7보다 높은 pH에서 흡광 스펙트럼의 강도를 측정하는 단계; 또는
b) 제19항 기재의 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)의 형성 여부를 검
사하기 위해, 선택된 파장에서 여기(excitation) 시의 형광도를 측정하는 단계.
공개특허 10-2005-0007454
- 45 -
청구항 37.
제19항 기재의 일반식 (XIV)로 표시되는 링커-단백질(단, 상기 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)과 활성 모
이어티 히드라지드와의 반응 정도 및/또는 반응 속도를 정량화하기 위한 비파괴적 방법으로서,
300 ㎚보다 큰 파장 및 7보다 높은 pH에서 흡광 스펙트럼의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 38.
제22항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서,
상기 일반식 (XV)에서,
R 2 는 H이고, X는 O이고;
상기 캐리어는 복수 개의 잔기 Q를 가지고;
상기 잔기 Q의 제1 선택%는 제1 활성 모이어티를 이용하여 유도화되며, 선택적으로
상기 잔기 Q의 제2 선택%는 제2 활성 모이어티를 이용하여 유도화되고,
상기 제조 방법은
a. 제19항 기재의 일반식 (XIV)로 표시되는 화합물(단, 상기 일반식 (XIV)에서, R 2 는 H이고 X는 O임)과 제24항 기
재의 일반식 (XVI)로 표시되는 제1 화합물을 7보다 낮은 pH에서 반응시키는 단계;
b. 300 ㎚보다 큰 파장에서 흡광 스펙트럼 강도를 측정함으로써 반응 과정을 모니터링하고, 상기 흡광 스펙트럼 강도
가 공지된 최대 강도의 제1 선택%에 도달할 때, 상기 반응을 중지시키는 단계; 및 선택적으로
c. 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 생성물을 제24항 기재의 일반식 (XVI)로 표시되는 추가의 1종 이상의 화합물과 반응
시키고, 300 ㎚보다 큰 파장에서 그 흡광 스펙트럼 강도를 측정함으로써 상기 반응 정도를 모니터링하고, 상기 흡광
스펙트럼 강도가 공지된 최대 강도의 제2 선택%에 도달할 때, 상기 반응을 중지시키는 단계
를 포함하는 방법.
청구항 39.
제22항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 상기 일반식 (XV)에서, R 2 는 H이고, X는 O임)로부터 활성 모이
어티 히드라지드의 방출 정도 및/또는 방출 속도를 정량화하기 위한 방법으로서,
300 ㎚보다 큰 파장 및 7보다 높은 pH에서 흡광 스펙트럼의 최대치를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 40.
제22항 또는 제25항에 있어서,
E 또는 G가 표지화 모이어티(labelling moiety)인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 41.
제22항 또는 제23항에 있어서,
상기 화합물이 수용액에 불용성인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 42.
제41항에 있어서,
E 또는 G가 분리할 분석 대상물 또는 화합물에 특이성이 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 43.
제42항에 있어서,
공개특허 10-2005-0007454
- 46 -
상기 화합물이 표지화 분자로부터 유래된 추가의 기 E 또는 G를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 44.
혼합물로부터 화합물을 분리하는 방법으로서,
상기 혼합물을 제22항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)에서, E 또는 G가 분리될 화합물과 특
이적으로 결합하는 리간드이고, 캐리어가 고체 지지체임)과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
청구항 45.
분석 대상물을 함유하는 것으로 추정되는 혼합물을 제22항 기재의 일반식 (XV)로 표시되는 화합물(단, 일반식 (XV)
에서, E 또는 G가 분석 대상물과 특이적으로 결합하는 리간드이고, 캐리어가 고체 지지체임)과 접촉시키는 단계를 포
함하는 분석 방법.
청구항 46.
제41항 기재의 화합물을 포함하는 상처 드레싱(wound dressing)으로서,
캐리어가 상처 드레싱에 통상적으로 이용되는 타입의 기능화된 폴리머이고, E 또는 G가 펩타이드 성장 인자, 화학유
인성 단백질(chemo-attractant protein), 리간드 또는 이들 중 1종의 유사체인
상처 드레싱.
청구항 47.
제41항에 있어서,
캐리어가 상처 드레싱에 통상적으로 이용되는 타입의 기능화된 폴리머이고, E 또는 G가 펩타이드 성장 인자, 화학유
인성 단백질, 리간드 또는 이들 중 1종의 유사체인 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 48.
상처 치료용 드레싱의 제조에 이용되는 제41항 기재의 화합물의 용도로서,
캐리어가 상처 드레싱에 통상적으로 이용되는 타입의 기능화된 폴리머이고, E 또는 G가 펩타이드 성장 인자, 화학유
인성 단백질, 리간드 또는 이들 중 1종의 유사체인 용도.
청구항 49.
제41항 기재의 화합물을 포함하는 투석용 튜빙(dialysis tubing)으로서,
캐리어가 투석 튜빙에 이용하는데 적합한 폴리머이고, E 또는 G가 헤파린인
투석 튜빙.
청구항 50.
제41항에 있어서,
캐리어가 투석 튜빙에 이용하는데 적합한 폴리머이고, E 또는 G가 헤파린이며, 투석 튜빙 제조용인 것을 특징으로 하
는 화합물.
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